范超中，庄满意，温 浩，李晨晨，普一涵，吕亚莉，李 静

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

白藜芦醇（Resveratrol，RES） 又名芪三酚，是一类主要存在于葡萄、虎杖、藜芦和花生等植物中的含有芪类结构的非黄酮二苯乙烯多酚类化合物[1]，作为一种天然的食品活性成分，是一类具有极大价值及潜力的抗氧化类药物[2]，被美国《抗衰老圣典》列为100 种最有效的抗衰老物质之一，在食品、营养补充品、化妆品、医药等行业有着广阔的应用前景。但其水溶性较低（仅2.68 mg/L）、稳定性较差、遇热见光易诱导转换、半衰期短（8～14 min）、代谢和排泄过于迅速[3-4]、生物利用度低等缺点严重影响了生理活性的发挥。因此，探究提高白藜芦醇的水溶性，促进其吸收并提高其生物利用度的方法，是目前食品营养领域研究的热点和难题。

作为一种被广泛研究的递药载体，脂质体具有无毒、两亲和生物可降解性等特征，可有效包裹维生素、矿物质、蛋白质、抗氧化剂等各类生物分子[5]。利用脂质体对白藜芦醇进行包裹构建递药体系，可以有效地解决白藜芦醇自身的稳定性问题，提高其在体内传递有效成分的效率及吸收利用率[2，6]。然而，脂质体成膜材料含有不饱和脂肪酸链的磷脂，容易导致膜结构稳定性差，易于融合形成大颗粒，从而引起药物渗漏，在某种程度上限制了其在临床上的应用。聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG） 是迄今为止已知蛋白和细胞吸收水平最低的亲水聚合物[7]，因其无毒性和良好的生物相容性，广泛应用于医药、食品等领域。目前，白藜芦醇脂质体在体外消化的研究并不多见，探究白藜芦醇脂质体在模拟胃肠道消化时的释药特征颇有必要。因此，采用低成本、操作简便的薄膜超声法设计单因素优化试验制备白藜芦醇脂质体，利用PEG-2000 对其修饰，采用红外光谱分析脂质体的结构，建立胃肠道连续消化体系，开展体外模拟消化研究。对提高白藜芦醇生物利用度具有潜在的理论价值和应用前景，也为拓展以脂质体为载体所建立的递药体系在食品药品领域中的应用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白藜芦醇、大豆卵磷脂、胆固醇、胃蛋白酶、胰蛋白酶，均为生物纯，索莱宝生物科技有限公司提供；PEG-2000（分析纯），天津大茂化学试剂厂提供；三氯甲烷（分析纯），天津市国药集团提供；聚乙烯醇（PVA），Mw13000-23000，87%～89%水解度，Sigma-Aldrich；氯化钠（分析纯），天津市光复科技发展有限公司提供；磷酸氢二钠、氯化钾、磷酸二氢钾、氢氧化钠、甲醇、无水乙醇、磷酸氢二钾、盐酸，均为分析纯，天津市化学试剂一厂提供。

1.2 仪器与设备

WE-Z 型水浴恒温振荡器，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；DK-8D 型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司产品；TGL-16M 型高速台式冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司产品；DHG 型电热鼓风干燥箱，天津市欧诺仪器仪表有限公司产品；Vector22 型傅立叶变换红外光谱仪，德国布鲁克光谱仪公司产品；TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；FG2 型便携式pH 计，梅特勒-托利多仪器（上海） 有限公司产品；KQ-500DE 型数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司产品；RS-52AA 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；ALPHA 1-2 型CHRIST 冷冻干燥机，北京五洲东方科技发展有限公司产品；HJ-6型磁力搅拌电热套，北京中兴伟业仪器有限公司产品。

1.3 白藜芦醇脂质体的制备

采用薄膜超声法制备白藜芦醇脂质体。准确称取大豆卵磷脂、胆固醇和RES，加入30 mL 1∶1 混合的甲醇与三氯甲烷，溶解搅拌90 min 后，于40 ℃下旋转蒸发，形成均匀的暗黄色薄膜，加入20 mL磷酸盐缓冲溶液（pH 值7.4） 洗膜，搅拌40 min，于20～25 ℃下水浴超声20 min，得到白藜芦醇脂质体（RES-L）；加入20 mL PEG-2000 的磷酸盐缓冲溶液（pH 值7.4） 洗膜，按上述方法操作，得到修饰的白藜芦醇脂质体（PEG-RES-L）。

1.4 包封率的测定

（1） 配置空白溶媒。吸取体积分数95%乙醇6 mL，加入磷酸盐缓冲溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL。

（2） 将制备好的RES-L 或PEG-RES-L 移入10 mL离心管中，以转速10 000 r/min 离心30 min，吸取200 μL 上清液后加入95%乙醇6 mL，再以磷酸盐缓冲溶液（pH 值7.4） 定容至10 mL，于波长306 nm处测定吸光度，计算游离的白藜芦醇量（A1）。

（3） 取RES-L 或PEG-RES-L 原液200 μL 加入95%乙醇6 mL，再以磷酸盐缓冲溶液（pH 值7.4）定容至10 mL，于波长306 nm 处测定吸光度，可得包封与未包封的白藜芦醇总量（A2）。

根据下列计算公式，得到样品中白藜芦醇的包封率[8]：

式中：EE——包封率，%；

A1——游离的白藜芦醇量，mg；

A2——包封与未包封的白藜芦醇总量，mg。

1.5 白藜芦醇脂质体的制备工艺优化

（1） 大豆卵磷脂与胆固醇的质量比。按照大豆卵磷脂∶胆固醇= 2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1测定脂质体的包封率，确定大豆卵磷脂与胆固醇的最佳质量比。

（2） 卵磷脂与白藜芦醇的质量比。按照大豆卵磷脂∶RES = 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1测定包封率，确定卵磷脂和白藜芦醇的最佳质量比。

（3） PEG-2000 质量浓度的影响。配制0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL PEG-2000 的磷酸盐缓冲溶液，测定脂质体的包封率，确定最佳的PEG-2000 质量浓度。

包封率最高的PEG-RES-L 做冻干处理，备用。

1.6 红外光谱（FTIR） 分析

分别取干燥的PEG-2000，RES，PEG-RES-L 冻干粉末1 mg 与溴化钾150 mg，研磨混匀，70 MPa下压透明薄片，测定400～4 000 cm-1的红外光谱。

1.7 体外消化试验

按照《中华人民共和国药典》2010 版二部附录所述的溶出度测定方法，对透析袋（截留相对分子质量为8 000～12 000） 沸水煮10 min，再用蒸馏水进行清洗，再泡于蒸馏水中备用。配置体外消化试验所用到的模拟胃液（Simulated gastric fluid，SGF）及模拟小肠液（Simulated intestinal fluid，SIF），37℃下备用，模拟白藜芦醇脂质体在体内胃肠道连续消化的情况。

SGF 配方：配置500 mL SGF 需加入1.0 g NaCl固体粉末1.6 g 胃蛋白酶（Pepsin），使用去离子水作为溶剂，用浓度为0.1 mol/L 的盐酸溶液调pH 值至1.2±0.1。

SIF 配方：配置500 mL SIF 需加入3.4 g 磷酸氢二钾和1.6 g 胰蛋白酶（Trypsin），使用去离子水作为溶剂，用浓度为0.2 mol/L 的NaOH 溶液调pH 值至7.5±0.1。

以模拟胃液及模拟肠液为释放介质，分别精密称取最佳包封率下0.2 g 制备好的PEG-RES-L 冷冻干燥粉末和148 mg RES 原料（RES 的量由制备好的PEG-RES-L 的最优包封率换算得来），移入经上述方法处理过的透析袋中，并向其中加入SGF 10 mL，置于含有50 mL SGF 的带塞锥形瓶中，再放入WE-Z 型水浴恒温振荡器，于37 ℃条件下，以转速100 r/min 实时取样2 mL，同时补加等体积的新鲜释放介质，120 min 后向透析袋（截留相对分子质量为8 000～12 000） 中加入SIF 10 mL 继续反应，同时释放液中补充50 mL SIF，取样。于波长306 nm 处测定吸光度，计算消化率。采用相同的方法测定白藜芦醇及未经修饰的白藜芦醇脂质体的消化行为，比较RES，RES-L 和PEG-RES-L 在体外模拟胃肠道连续消化时的情况。

1.8 白藜芦醇脂质体的稳定性试验

将等量RES-L 和PEG-RES-L 于4 ℃下避光保存，分别在第2，4，6 天进行包封率测定，分析其稳定性。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇脂质体的制备工艺优化

2.1.1 大豆卵磷脂与胆固醇质量比

大豆卵磷脂与胆固醇质量比对白藜芦醇脂质体包封率的影响见表1。

表1 大豆卵磷脂与胆固醇质量比对白藜芦醇脂质体包封率的影响

由表1 可知，当大豆卵磷脂与胆固醇质量比为2∶1 和6∶1 时，得到的包封率较高，分别为88.9%和89.6%。一般而言，胆固醇因其表面活性剂作用可以提高水油混合型乳液的稳定性。因此，在构建脂质体载药体系过程中其占比与制备后载药脂质体的包封率呈正相关；但是，当胆固醇含量超过该比例范围时，磷脂含量过低，易导致成膜困难，再加之人体所能消化的胆固醇量有限，无法利用和消化的胆固醇会在血液中积累。因此，考虑到脂质体的稳定性及胆固醇含量对人体的影响，选择6∶1 作为大豆卵磷脂与胆固醇的最佳质量比。

2.1.2 脂药比的影响

固定大豆卵磷脂与胆固醇的质量比为6∶1，改变大豆卵磷脂和白藜芦醇质量比。

脂药比对白藜芦醇脂质体包封率的影响见表2。

表2 脂药比对白藜芦醇脂质体包封率的影响

由表2 可知，随着脂药比的增大，RES-L 包封率先上升后下降，说明在一定范围内增加脂质体量可以更有效地包裹药物，但当脂药比超过20∶1 后，包封率下降，可能会造成脂质体及药物的双重损失。因此，选择大豆卵磷脂与白藜芦醇的最佳质量比为20∶1，白藜芦醇脂质体包封率可达86.10%。

2.1.3 PEG-2000 质量浓度的影响

采用0.25，0.50，1.00，1.50 mg/mL 的PEG-2000磷酸盐缓冲溶液进行洗膜，测定PEG-RES-L 包封率。

PEG-2000 质量浓度对PEG-RES-L 包封率的影响见表3。

表3 PEG-2000 质量浓度对PEG-RES-L 包封率的影响

由表3 可知，当PEG-2000 磷酸盐缓冲溶液的质量浓度为1 mg/mL 时PEG-RES-L 具有最大的包封率。因此，选择1mg/mL PEG-2000 磷酸盐缓冲溶液进行脂质体制备。

2.2 白藜芦醇脂质体的分子结构分析

RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的红外光谱图见图1。

图1 RES，PEG-200 及PEG-RES-L 的红外光谱图

由图1 可知，RES 在3 250 cm-1处有酚羟基吸收峰，在1 620，1 540，1 500 cm-1处有苯环吸收峰，在965 cm-1处有反式-C = C- 特征吸收，700 cm-1处为顺式-C = C- 的特征吸收[9]。比较RES，PEG- 2000 与PEG-RES-L 的FTIR 图谱发现，RES 的光谱特征消失。其原有的许多特征峰强度和峰型都发生了变化，强度大为减弱峰型也不再尖锐，甚至不再出现，这表明所形成的脂质体已经成功包埋了RES，使其分子振动受到限制而不能显示其原有的红外特征。

同时，PEG-2000 的羟基吸收峰3 430 cm-1变宽，2 889 cm-1吸收峰向长波数2 925 cm-1移动，表明在脂质体的形成过程中发生了蓝移现象，1 467，1 345，1 280 cm-1的吸收峰也消失不见了，这些都表明在脂质体形成过程中发生了一定程度的化学反应，可能是由于RES 上的羟基结构与PEG-2000长链上的氧原子发生了氢键缔合作用，将聚乙二醇成功修饰到白藜芦醇脂质体上。

2.3 体外模拟消化研究

脂质体中药物释放机理复杂，药物在脂质体中包埋的位置、药物本身的分子大小和性质、脂质体的粒径大小和密度及释放环境等对药物从胶囊内的释放均有影响。将RES，RES-L 及PEG-RES-L 分别加入含有50 mL 的胃液中，于37 ℃下以转速 100 r/min 反应120 min 后向透析袋中加入等体积肠液，继续反应120 min，测定吸光度，计算RES，RES-L及PEG- RES-L 在4 h 内体外模拟胃肠道连续消化的结果。

PEG-RES-L，RES-L 与RES 模拟胃肠道连续消化释放图见图2。

图2 PEG-RES-L，RES-L 与RES 模拟胃肠道连续消化释放图

由图2 可知，RES 在4 h 内的累计消化率最高，为45.88%；RES-L 次之，为35.82%；而PEG- RES-L的消化率最低，仅为26.44%，且具有更明显的缓释效果。从药物释放曲线可以看出PEG-RES- L，RES-L 在第0～30 min 内消化较快，而在第30～120 min 内消化平稳，这是由于在制备过程中有部分未被包裹的RES 沉淀吸附在其表面，当样品进入模拟胃液后，这部分RES 会首先扩散溶解。此外，3 种样品的消化率均在第120 min 时大量增加，体外消化体系中加入了模拟肠液，表明脂质体在模拟肠液的消化中消化速率增大，PEG-RES-L 在体外模拟胃肠道的消化过程中累计释放量更低，较未包裹的RES 及未经修饰的RES-L 更能在复杂的人体环境内维持稳定，且具有一定的缓释效果，这对于提高白藜芦醇在人体内的生物利用率有着积极意义。

经PEG-2000 修饰的白藜芦醇脂质体的消化情况见图3。

图3 经PEG-2000 修饰的白藜芦醇脂质体的消化情况

图3 更为直观地展示了PEG-RES-L 在体外模拟胃肠道消化的情况，在连续测定的4 h 内，PEGRES-L 在胃液环境中释放量占总释放量的29.93%，而加入肠液后，胃肠液累计释放量达70.06%。

2.4 稳定性测试

包封率是脂质体对于药物的包封能力的直接体现，是否能够长期稳定地包裹药物，降低药物泄漏率是评价脂质体稳定性的一个重要指标。表4 分别测定了RES-L 及PEG-RES-L 原液及离心后上清液在4 ℃避光保存时第2，4，6 天的吸光度值，并计算包封率。

白藜芦醇脂质体稳定性分析见表4。

表4 白藜芦醇脂质体稳定性分析

试验结果发现，RES-L 经过6 d 的稳定性测试，包封率下降幅度较大，从77.25%下降至25.08%；而PEG-RES-L 在6 d 里包封率下降了18.32%，由此可见，经过PEG-2000 修饰的白藜芦醇脂质体在包封性能上更加稳定，更能抵抗长期储存时环境的温度、pH 值、湿度等因素对于脂质体稳定性的影响。

3 结论

利用薄膜超声法制备了PEG-2000 修饰的白藜芦醇脂质体。单因素试验最终确定大豆卵磷脂∶胆固醇（质量比） = 6∶1，大豆卵磷脂：RES（质量比） =20∶1，PEG-2000 磷酸盐缓冲溶液质量浓度为 1 mg/mL 时，PEG-RES-L 的包封率最好。红外光谱图证实了RES 被成功包裹进脂质体内，PEG-2000 通过氢键作用修饰到了白藜芦醇脂质体上。体外消化研究结果表明，修饰的PEG-RES-L 在体外模拟胃肠道连续消化体系中消化率较低，为26.44%；而RES 及RES-L 的 消 化 率 分 别 为 45.88% 和 35.82% ；PEG-RES-L 在胃液中的累积释放量仅为总释放量的29.93%，远低于在肠道的释放量（70.06%）。PEG-RES-L 在体外模拟胃肠道的消化较RES 及未修饰的RES-L 更能在复杂的人体环境内维持稳定。稳定性试验证明，经过PEG-2000 修饰的白藜芦醇脂质体在包封性能上更加稳定，更能抵抗长期储存时环境的温度、pH 值、湿度等因素对于脂质体稳定性的影响。