吴昌学，赵 艳，张 婷，张 健，禹文峰，柏 华，张启芳

(1. 贵州医科大学地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州贵阳 550004；2. 贵州省医学分子生物学重点实验室，贵州医科大学，贵州贵阳 550004；3.贵州医科大学第三附属医院医学中心实验室，贵州都匀 558000)

三氧化二砷(As2O3; arsenic trioxide, ATO)能有效抑制急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)，但是对非APL的急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)抑制效果不明显[1]，说明AML细胞对ATO耐药，但耐药机制不清。

ATO作用细胞的方式多样，除了诱导细胞凋亡和自噬[2-3]，ATO还能够诱导肿瘤细胞产生氧化应激产物(reactive oxygen species, ROS)[4-5]。ROS在化疗中具有双面性质。大量ROS可以杀死大部分肿瘤细胞，但是ROS能促使肿瘤细胞上调抗氧化基因表达以消除大量的ROS，以致于个别肿瘤细胞幸存，产生耐药[6-7]。越来越多的证据表明，AML细胞中ROS水平高于正常成髓细胞[8-9]。由于AML细胞已经上调其抗氧化蛋白以补偿ROS的剧增，因此无法耐受额外的ROS，而靶向的谷胱甘肽代谢可以使AML细胞减少[10]。也有研究报道，二氯乙酸则可以上调ATO诱导的ROS增强，从而达到抑制AML的作用[11]。这些研究说明，抑制AML细胞抗氧化能力或上调ROS水平是提高对AML细胞抑制能力的有效途径。

本课题组前期的研究表明，抑制AML细胞的信号传导和激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)活性能够抑制AML生存、增殖和诱导细胞凋亡的能力[12-13]。同时发现，激活乳腺癌细胞STAT3可以减少ROS，增强放疗耐受，而抑制STAT3则可增加ROS，增强放疗的敏感性[14]。研究还发现，ATO通过联合抑制JAK1/JAK2来抑制STAT3活性，增强ROS水平，可有效地抑制淋巴瘤细胞U937的凋亡[15]。激活STAT3增强肿瘤细胞耐药、上调抗氧化因子Nrf2水平[16]。而Nrf2则有助于AML化疗耐受[17]。这说明抑制STAT3活性是抑制细胞抗氧化能力和增加ROS水平的有效手段。

AML在遗传上具有高度异质性，这导致许多靶向药物效果不佳[18]。因此，针对细胞基本的特性，例如独立于任何特定遗传突变的氧化还原性状态似乎是比较合理的策略。基于此，本研究通过观察STAT3抑制剂Stattic对ATO诱导AML的THP1细胞株生存和凋亡的影响，初步探讨STAT3抑制剂联合ATO对AML的作用机制，为临床选择ATO联合用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂、抗体和试剂盒Roswell Park Memorial Institute -1640(RPMI-1640)培养液、胎牛血清为美国Gibco公司产品。Stattic购自Selleck；ATO、DCFH-DA购自Sigma(St. Louis, MO, USA)，Trizol购自美国Invitrogen公司；P-Tyr-STAT3、STAT3、Nrf2、β-Tubulin和辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国CST公司。CCK-8、Annexin V/PI和qPCR试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司；cDNA合成试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 细胞培养THP1细胞株购自美国典型培养保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)，培养在含100 mL/L澳洲胎牛血清(Gibco)、1×Antibiotic- Antimycotic(Gibco)的RPMI-1640养液(Gibco公司)中，培养条件为含50 mL/L CO2的37 ℃培养箱。

1.3 Western blotting检测收集细胞，1 500 r/min离心5 min，PBS洗2次并离心后加入预冷的细胞裂解液(20 mmol/L HEPES, 150 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，200 mL/L glycerol，10 mL/L Triton X-100，1×蛋白酶抑制剂)，冰上孵育20 min, 14 000 r/min离心15 min后取上清(即总蛋白)，用Bradford测量蛋白浓度。在提取的总蛋白中加入上样缓冲液，混匀后95 ℃煮10 min。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1 h，用含50 g/L脱脂奶粉的TBS溶液按1∶1 000稀释一抗，将膜放在一抗中室温孵育2 h。用含50 g/L脱脂奶粉的TBS溶液按1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，将洗好的膜在二抗中室温孵育1 h。ECL超敏免疫印迹检测试剂(Amersham公司)检测蛋白表达，用化学发光法曝光显影，Image J分析蛋白条带灰度值。

1.4 CCK-8测定细胞存活率取对数生长期细胞，接种细胞在96孔板，1×104细胞/孔。用10 μmol/L Stattic和ATO(1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μmol/L)组合处理THP1细胞48 h。采用CCK8 Kit检测细胞生存能力。按说明书操作，酶标仪的吸光度设定在450 nm处读取A值。计算细胞存活抑制率：细胞抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5 细胞凋亡检测用DMSO、ATO或Stattic处理THP1细胞，终浓度为1.0 nmol/L，在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱孵育48 h，收集细胞，按说明书Annexin V/PI双染细胞凋亡。样品准备好后上流式细胞仪测试，以DMSO组作为空白对照，数据用FlowJo V10软件(treestar)分析数据。Caspase-Glo®3/7法检测细胞凋亡。

把160 000个/μL THP1细胞100 μL接种于96孔不透明白板，按实验方案加入DMSO或Stattic或ATO处理6 h。按照Caspase 3/7 Glo(Promega)试剂盒说明书进行操作。用药细胞处理到达时间时，取出96孔板，平衡至室温。每孔加入100 μL Caspase-Glo®3/7试剂，混匀，室温孵育90 min。读板机读取荧光值。不含细胞的培养基样品吸收值作为背景值，DMSO处理的细胞样品作为阴性对照。

1.6 ROS检测收集细胞离心，弃上清，加入用无血清液体稀释的10 μmol/L DCFH-DA工作溶液悬浮细胞，在37 ℃下孵育细胞30 min。每3～5 min反转1次混合物，使探针和细胞完全接触。随后用无血清细胞培养基洗涤细胞3次，并通过流式细胞术检测荧光(525 nmol/L)，用FlowJo V8软件(Treestar)分析数据。

1.7 Real-time PCR检测将对数生长期的细胞以1×106个/孔细胞密度接种于6孔板中，分别加入2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic，DMSO作为对照组，培养48 h。Trizol法提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定RNA样品吸光度比值，取1 μg RNA 逆转录为cDNA。采用荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测目的基因的mRNA表达。GCLC上游引物5′-TTGAGGCCAACATGCGAAA-3′，下游引物5′-AGGACAGCCTAATCTGGGAAATG-3′；GCLM上游引物5′-GGCACAGGTAAAACCAAA-TAGTAAC-3′，下游引物5′-CAAATTGTTTAGCAAATGCAGTCA-3′；HO-1上游引物5′-ATGGCCTCCCTGTACCACATC-3′，下游引物5′-TGTTGCGCTCAATCTCCTCCT-3′。内参β-actin引物为：上游5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAA-G-3′，下游5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反应条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃退火30 s，40个循环。采集待测目的基因和内参(β-actin)的Ct值，计算ΔΔCt及相对表达量(RQ)，RQ=2-平均ΔΔCt。

1.8 生物信息分析HO-1表达用Online软件GEPIA Ⅱ分析the cancer genome atlas(TCGA)AML数据库患者HO-1 mRNA 表达水平(Gene Expression Profiling Interactive Analysis Ⅱ, http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)，分析参数设置：Log2FC cutoff is 1,P-value cutoff is 0.01[19]。

2 结 果

2.1 Stattic增强ATO对THP1细胞的生存抑制用10 μmol/L Stattic处理THP1细胞6 h，与预期一致，Western blotting结果显示Stattic显著地抑制P-STAT3活性(P<0.001，图1A)。与ATO单独处理相比，在ATO为2.5 μmol/L时与Stattic的联合就显著地增强ATO介导的细胞生存抑制(图1B)。

图1 Stattic增强ATO对THP1的生存抑制

2.2 Stattic增强ATO诱导的细胞凋亡为了检测Stattic对ATO诱导的凋亡影响，本研究联合2 μmol/L ATO与10 μmol/L Stattic处理THP1细胞：用ATO处理THP1细胞48 h时，流式细胞术检测结果显示ATO诱导21.2%的细胞凋亡，联合Stattic可诱导33.4%的细胞凋亡(图2A)。同样，Stattic联合ATO也显著增强Caspase 3/7的活性(图2B)。

2.3 Stattic对ATO介导的ROS水平影响 用2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic处理THP1细胞6 h，收集细胞，用DCFH-DA工作溶液染色细胞，流式细胞仪检测荧光强度(525 nmol/L)，Stattic对ATO-介导的ROS影响。结果显示，ATO显著诱导ROS水平升高，Stattic具有促进ATO诱导ROS水平升高的作用(图3)。

图2 Stattic加剧了ATO诱导的THP1细胞凋亡

图3 Stattic增强ATO诱导的ROS水平

2.4 Stattic对As2O3介导的Nrf2表达的影响用2 μmol/L ATO或10 μmol/L Stattic单一或组合处理THP1细胞6 h，用β-Tubulin作为内参照，Western blotting检测Nrf2表达水平，结果显示，ATO显著上调Nrf2表达(P<0.001)，而Stattic明显降低ATO诱导的Nrf2的表达(P<0.001，图4)。

图4 Stattic抑制ATO上调的Nrf2表达

2.5 Stattic对Nrf2下游基因表达的影响qPCR检测结果显示，ATO显著诱导Nrf2部分下游基因GCLC、GCLM和HO-1的mRNA表达，而Stattic明显抑制ATO上调的这些基因表达(图5)。Online软件GEPIA Ⅱ分析TCGA数据库AML患者HO-1的mRNA表达，结果显示HO-1在AML患者中异常高表达。

图5 qPCR检测ATO和Stattic对GCLC、GCLM和HO-1 mRNA表达的影响

3 讨 论

AML是遗传学上具有高度异质性的髓系恶性肿瘤。有研究报道，ATO3抑制APL效果显著，但AML细胞对ATO有抗性，机制不清。本研究结果显示，ATO诱导的抗氧化转录因子Nrf2表达增强了AML细胞耐药性，联合STAT3抑制剂Stattic能够有效抑制ATO上调Nrf2表达，增加ATO诱导的ROS水平，从而增强ATP介导的THP1细胞生存抑制、细胞凋亡。表明ATO联合抑制STAT3活性具有协同抑制AML细胞作用。

本研究结果显示，ATO不仅诱导ROS产生，而且也上调了Nrf2/HO-1表达, 这也可能是AML细胞对ATO产生耐药的原因之一，该发现支持Nrf2增强AML细胞耐药性的文献报道[18]。本研究还采用STAT3抑制剂Stattic联合ATO处理THP1细胞，研究STAT3调控Nrf2表达和ROS水平的作用，结果显示，Stattic增强了ATO对THP1细胞的生存抑制、加剧ATO诱导的细胞凋亡。提示ATO联合Stattic增强了ATO诱导的ROS。有文献报道，通过抑制谷胱甘肽可增加ROS消除AML细胞[10]，而二氯乙酸可增强ATO诱导的ROS，上调ATO抑制AML的效果[11]，芦可替尼(Ruxolitinib)通过抑制JAK1/2来抑制STAT3活性，上调ROS增强ATO诱导的淋巴瘤细胞U937 增殖和凋亡[15]。本研究结果也进一步验证上述的文献报道结果。

为了探讨Stattic对ATO药物增效的分子机制，本研究检测Stattic对STAT3活性、Nrf2/HO-1表达的影响。结果显示，Stattic不仅能显著地抑制STAT3活性，还能抑制Nrf2/HO-1的表达。这也与文献报道STAT3活性上调Nrf2表达类似[16]。为了进一步证明Nrf2表达被下调，本研究更进一步检测了Stattic对Nrf2的一些下游基因表达的影响，结果发现GCLM和GCLC均被抑制，提示Stattic也可抑制Nrf2/HO-1通路。有文献报道与本研究结果不一致，虽然Stattic通过抑制STAT3活性诱导THP1细胞凋亡，但是也上调ERK活性[19]。ERK活性的上调支持AML细胞存活[20]。

本课题组的前期研究发现，抑制STAT3活性可以抑制AML生存并诱导AML细胞凋亡[21]。此外，STAT3是重要的免疫检查点之一。研究组前期工作用CpG-Stat3 siRNA沉默STAT3表达，不仅诱导AML细胞凋亡，还增强了STAT3介导的免疫抑制，提高了AML小鼠免疫细胞功能，有效抑制AML细胞生长[21]，还能降低人原代AML细胞的免疫抑制作用[22]。本研究结果也显示，Stattic不仅通过ATO抑制STAT3，而且抑制了ATO上调的Nrf2表达，显著地降低AML对ATO的抗性。鉴于STAT3高表达抑制抗癌免疫细胞功能、增强免疫抑制细胞功能，ATO联合Stattic有望成为抑制AML细胞生存、增强AML细胞免疫原性、提高AML患者免疫功能的组合。

综上所述，本研究发现Stattic可增强ATO对AML细胞生存抑制和凋亡诱导作用，其机制可能与抑制Nrf2 和Nrf2下游基因表达引起的ROS增多有关。但本研究有2个局限：只在1个AML细胞株上完成；没有在动物实验上验证。这在下一步的研究中将进行补充。