唐雪妹 赵晓丽 高毓文 叶倩 朱富伟 苏连水 万凯

摘  要：橄榄含有丰富的生物活性物质，这些成分的含量与橄榄品种、加工过程及储存条件等密切相关。分析我国乌橄榄和青橄榄2个主栽橄榄品种，利用液相色谱-高分辨质谱（UPLC-Q-orbitrap-MS）结合统计学模型进行综合评价。结果表明：利用非靶向代谢物分析流程筛选鉴定出47种显著性差异代谢物，其中氨基酸9种，黄酮多酚类20种，油脂类8种，有机酸类3种，香豆素类化合物2种，其他5种。乌橄榄中含量较高的物质有山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、罗汉松脂素、高车前苷、杨梅素、花旗松素、1-棕榈酰-2-月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱PLPC、桐油酸、甘草次酸，青橄榄中含量较高的物质有鞣花酸、短叶苏木酚酸、没食子酸及相应的葡萄糖苷，这些物质在2个品种中的平均含量比率超过30倍以上。这表明不同橄榄品种内源性代谢物存在明显差异且各具特色，为今后橄榄品质评价、资源合理利用及不同产品的深度开发提供数据支撑。

关键词：UPLC-Q-orbitrap-MS;非靶向;橄榄;代谢物

中图分类号：S59      文献标识码：A

Abstract： Olives （Olea europaea L.） are rich in biologically active substances， and the content of the components is closely related to olive varieties， processing and storage conditions. The chemical constituents of table olive were ana-lyzed by UltraHigh Performance Liquid Chromatography-Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometry （UPLC-Q-orbitrap- MS） combined with statistical analysis. A total of 47 significantly different metabolites were identified from the chro-matograms of 2 olive varieties. The compounds included 9 kinds of amino acids， 20 kinds of flavonoids and poly-phenols， 8 kinds of lipids， 3 kinds of organic acids， 2 kinds of coumarin compounds， and 5 kinds of other compounds. Juglalin， matairesinol， plantagoside， myricetin， taxifolin， PLPC， α-eleostearic acid and 18-β-glycyrrhetinic acid showed the highest values in Canarium pimela Koening. Ellagic acid， brervifolincaboxylic acid， gallic acid and its corresponding glucosides showed the highest values in Canarium album. The average content ratio of the substances in the two varie-ties is more than 30 times. The results showed that there were significant differences in the endogenous metabolites among different olive varieties and each had its own characteristics， which would provide data support for the future olive quality evaluation， rational utilization of olive resources and in-depth development of different olive products.

Keywords： UPLC-Q-orbitrap-MS; untargeted; olive; metabolomics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.006

橄欖是一种重要的经济作物，广泛分布于地中海国家以及我国南部。从橄榄果中产生的橄榄油具有较高的营养价值，在人类饮食中发挥重要角色。同时，橄榄也可作鲜食和加工成凉果，是著名的亚热带特色水果[1]。新鲜成熟的橄榄果肉含有丰富的生物活性物质，如多酚、黄酮、Vc、蛋白质及微量元素等，从而使橄榄具有抗氧化、抗心血管疾病、抗癌、抗炎症等生物功效[2-4]。橄榄产品生物活性物质含量与橄榄品种、成熟程度、工业发酵过程以及储存条件等密切相关。因此，开发一种新的有效方法来分析判别橄榄品种代谢组分的差异，找到其代谢标志物，对于橄榄油的真伪鉴别及促进橄榄鲜果的高效加工利用具有重要意义。

橄榄品种虽繁多，但良莠不齐，缺乏科学的开发利用依据，严重阻碍橄榄产业的健康发展。橄榄品种间有机酸、蛋白质、Vc、可溶性固形物和矿质元素等营养成分及含量的差异，在一定程度上反映了橄榄品种的遗传差异，对橄榄鲜食品种、鲜食配套品种以及加工品种的确定也具有现实意义[5-6]。大量的研究结果表明，不同橄榄品种品质和口感差异与其内在代谢物的种类和含量密切相关。何志勇等[7]提出橄榄果实多酚类物质如黄酮、单宁等含量是影响果实鲜食的主要因素;赵金星等[8]研究发现橄榄果实风味的形成与糖酸等物质关系小，与酚类物质关系密切。近几年，采用色谱质谱技术对鲜食橄榄特征生物活性成分的研究得到了越来越多的关注，尤其是内源性代谢物如多酚物质、气味芳香物质的挖掘[9-11]。然而，从代谢组学层面深入研究橄榄品质特征，以及不同品种橄榄果实代谢物差异成分比较等研究比较缺乏，不利于橄榄资源合理利用及橄榄不同产品的深度开发。

青橄榄和乌橄榄是我国南方特有的药食两用水果，与国外的油橄榄差别甚大，是加工型水果，果肉除生吃亦可腌制和药用。本研究主要利用UPLC-Q-orbitrap-MS结合多变量统计学分析，对我国主要的2类橄榄的化学成分差异进行对比分析，寻找品种间的生物标志物。采用非靶向代谢组学策略，可有效地帮助科研人员更好地分析复杂体系的化学组成，挖掘更多有用的信息，探明不同橄榄品种成分的显著性差异，为橄榄果实有效加工和利用提供参考依据。

1  材料与方法

1.1  材料

本研究于2018年11—12月在广东省橄榄主产区采集25个鲜食橄榄样品，其中广州增城采集10个乌橄榄，潮州普宁采集14个青橄榄和1个乌橄榄（表1）。每个样本均采摘于果实成熟期，由人工随机采摘的200个成熟个体混匀组成。

1.2  方法

1.2.1  样品提取  新鲜橄榄采摘后，果实表面用去离子水洗净、晾干，将果肉和果核分开，弃去果核部分。取适量果肉置于匀浆机中研磨捣碎至粉末状，于–80 ℃冰箱保存。准确称量2 g橄榄样于离心管中，加入80%甲醇水溶液10 mL，涡旋混匀，室温条件下超声萃取30 min;8000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清。残渣再加10 mL甲醇重复提取2次，合并上清液。上清液部分旋转浓缩近干，用80%甲醇水溶液定容至1 mL，过0.22 μm PTFE滤膜，于–20 ℃保存待用。

1.2.2  UPLC-Q-orbitrap-MS分析  采用赛默飞Q-Exactive液质联用仪，使用Tracefinder软件实现仪器控制、数据采集及数据分析。色谱柱使用C18 Accucore aQ（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）柱，0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）作为流动相，流速设置0.3 mL/min。色谱分离条件为：0～2 min，10% B;2～12 min，10%～80% B;12～15 min，80% B;15～ 18 min，80%～10% B;保持10% B平衡2 min，整個分析时间为20 min。柱温35 ℃，进样体积5 μL。

质谱分析条件：离子源参数，使用ESI电离源在正负离子切换模式下进行质谱数据采集，喷雾电压4 kV（正离子模式），3.5 kV（负离子模式）;鞘气（N2>95%）为40 bar;辅助气体（N2>95%）为10 bar;加热器温度300 ℃;离子传输管温度320 ℃。一级扫描模式MS Full Scanning mode，质荷比（m/z）为100～1000，分辨率为70 000。二级质谱扫描模式采用数据依赖采集（dd-MS2），分辨率为17 500。高能碰撞解离（HCD）的能量设置为阶梯模式（20、40、60 eV）

1.2.3  质量控制  从每个样品提取液中取相同体积样品混合组成质控样（QC），用于数据的稳定性和重复性评估。在UPLC-Q-orbitrap-MS分析过程中，每5个样品中插入1个质控样，用于监测方法的稳定性和数据的可靠性。

1.3  数据处理

液质采集的原始数据文件直接导入compound discover软件分析，经过峰检测、提取、去卷积、归一化、峰对齐等处理后，生成包含质荷比、保留时间、峰面积的代谢物数据集，该数据集可进一步用于统计学分析。前处理得到数据集用SIMCA-P软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）。PCA得分图可清楚的区分不同种类和不同地区的样品，采用OPSL-DA模型比较2个不同样品，从而实现特征生物标志的挖掘。

2  结果与分析

目前，考虑样品的化学复杂性，为了获得更为完整的信息，代谢组学策略已经由单独目标物或者已知一类物质的检测向全面信息检测转变。本研究采用非靶向代谢组学研究不同品种橄榄化学成分差异，具体分析流程如图1所示，首先采用UPLC-Q-orbitrap-MS采集橄榄样品的植物化学指纹图谱，获得样品数据集，再利用PCA统计学模型对不同类型橄榄进行初步聚类分析，随后OPLS-DA及变量选择方法变量权重值（VIP）、S图（S-plot）等筛选出不同品种橄榄的特征化合物，从而实现不同品种样品间差异化学成分分析和鉴定。

2.1  橄榄指纹图谱

为了从橄榄样品中萃取更多有效成分，从而获得样品的全面信息，需要选择合适的分析条件包括提取方法和质谱分析方法。根据文献调研，在大部分植物代谢物研究中，均采用水和甲醇作为萃取溶剂，超声辅助萃取可有效提高萃取效率[12]，因此本研究采用超声萃取的提取方法，同时，考察3种溶剂100%甲醇、70%甲醇和纯水的提取效果。结果表明，70%甲醇可提取出更多的代谢物成分，萃取效果优于100%甲醇和纯水。甲醇具有较高的极性，溶解性好，可萃取大部分极性代谢物。此外，橄榄是果实含水量较少的水果，一定含水量的甲醇提取溶液可同时有效提取脂溶性代谢物和水溶性代谢物，因此，本研究选择70%甲醇，超声辅助萃取作为橄榄样品的最优提取方法。

使用UPLC-Q-orbitrap-MS系统在最优的流动相组成和洗脱梯度下对不同品种的橄榄果肉甲醇提取物进行分析，得到橄榄样品的代谢轮廓指纹图谱。如图2所示，负离子模式下，2种不同橄榄的代谢成分存在明显差异，如乌橄榄在2～12 min出现的峰对应的物质种类和相对含量与青橄榄明显不同，12 min后仍可见多个特异性峰（图2A）。同样，正离子模式下，2种橄榄的代谢指纹图谱差异明显，乌橄榄在保留时间 7～8 min以及12 min后具有显著差异性峰，青橄榄在1.77 min和8～9 min之间有特征峰出现（图2B）。此研究结果为后续统计学分析差异性代谢物奠定基础。

2.2  统计学分析及差异代谢物筛选

在最优的条件下分析所有的橄榄样品，通过合适的参数设置，用compound discover自动提取到9586个代谢物。多变量统计学方法PCA已经被广泛用于评估产品质量、追踪产物起源、辨别劣质产品等过程的数据分析[13]。PCA的基本原理是使用数学程序将多个相关的变量转变成少个不相关的变量，称之为主成分（PCs）。本研究用SIMCA-P软件对检测到的橄榄数据进行PCA，主要以峰面积作为变量来观察样品直接的变化。图3是30个样品的PCA 得分图和荷载图。PCA得分图可直观地反映出不同品种橄榄样品的差异。如图3所示，在主成分1和主成分2的二维图上， 30个样品可清楚的分为几个组，一个样品出现在95%置信区间以外，可判断为异常值，这个异常值可能是原材料差异或者保存过程中引起的变化。在PCA得分图中可看到QC样品均集中在中心位置，且分布紧密，说明本方法利用UPLC- Q-orbitrap-MS获得数据具有很好的重现性和稳定性，数据可靠，可用于橄榄的代谢组学分析。此外，各品种样品组内聚集在一起，不同品种样品之间相距较远，在空间上可明显区分，聚类趋势明显，说明几组样品的代谢产物在种类、数量和浓度等方面存在差异。PCA得分图可有效的展示异常值、组别及其他类型的研究样品。

由非监督模式的PCA模型初步判断样品组别后，采用有监督模式的OPLS-DA分析数据，该模型可降低系统噪声的干扰，提高分类效能。经7次循环交互验证（7-fold cross-validation）得到的模型评价参数，本研究数据建立的OPLS-DA模型的R2Y为99.2%，R2Q均为96.6%，说明该模型具有较好的拟合性和预测性。图4是建立OPLS-DA得分图，青橄榄和乌橄榄在第一主成分轴上明显分开，说明青橄榄的代谢成分明显区别于乌橄榄。由此可知，不同品种对橄榄代谢物会产生一定的影响。通过OPLS-DA分析，代谢物和样品之间的关系可用于品种辨别及产地溯源分析。

为找出青橄榄和乌橄榄品种间的潜在差异化学标志物，进行扩展统计分析得到S-plot图（图5A）。在S-plot图中，每一个点代表着一个保留时间和质荷比组成的变量（t-m/z pair），X轴表示变量的贡献，离零点越远的变量，对两组样品区分贡献越大。Y轴表示变量可信度，离零点越远的变量，对样品区分的置信水平越高。因此，处在“S”曲线两端的离子，可作为区分不同品种橄榄的潜在化学标志物。此外，利用OPLS-DA模型得到的VIP来衡量各代谢物的表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，挖掘具有生物学意义的差异代谢物。本研究选择OPLS-DA统计分析VIP>1，|fold charge|>2以及students’t-test P<0.05的代谢物为具有显著性差异的代谢物，共筛选出47个差异明显的化合物，这些物质可借助高分辨质谱的优势进行结构鉴定。

2.3  显著性差异代谢物鉴定

在代谢组学中，未知化合物的鉴定是目前主要难点之一。本研究代谢物鉴定采用基于高分辨质谱的非靶向分析流程，即采用全扫描结合数据依赖二级质谱分析（full scan-ddms2），提取准确的质荷比、保留时间、同位素峰比及二级碎片离子，与内部数据库及在线数据库如massbank da-tabase （https：//massbank.eu/），human metabolome databases （HMDB， http：//www.hmdb.ca/），Metlin database （http：//metlin.scripps.edu）代谢谱图库进行对比检索。同时，鉴定到的物质与文献报道和标准品进行确认，初步预测和鉴定化学组成成分。以山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷为例，在样品中通过准确分子量可提取目标化合物，确认该物质在每个样本中的相对含量，二级碎片则可提供详细的结构信息。m/z 419.09665预测组成为（C20H18O10+H）+离子，通过碰撞诱导解离，产生山奈酚特征峰287.0547 （C15H10O6+H）+，丢失132 Da （C5H8O4），因此，该化合物鉴定为山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷，再通过与库中标准物质二级碎片比对确认结构。

本研究鉴定的区分不同种类橄榄的重要代谢物及相关信息见表2，经过分析发现，青橄榄和乌橄榄2个品种中差异最明显的代谢物主要为氨基酸、多酚类、黄酮类及脂质等。其中乌橄榄中含量较高的物质有山柰酚-3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖苷、罗汉松脂素、高车前苷、杨梅素、花旗松素、1-棕榈酰-2-月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱PLPC、桐油酸、甘草次酸，青橄榄中含量较高的物质有鞣花酸、短叶苏木酚酸、没食子酸及相应的葡萄糖苷，这些物质在2个品种中的平均含量比率超过30倍以上。由此可见，在乌橄榄中黄酮类化合物和油脂类化合物相对较丰富，在青橄榄中多酚类化合物含量更高。

3  讨论

代谢组学技术在果实品质方面研究虽然起步较晚，但随后发展迅速且应用非常广泛[14]。本研究利用高分辨质谱结合多元统计分析，从非靶向代谢组学角度，对不同鲜食橄榄代谢差异成分进行分析。结果表明，橄榄果肉中含有丰富的氨基酸、油脂、生物碱、多酚、黄酮类物质，因此，鲜食橄榄具有独特的苦涩味和诸多药理作用，然而不同品种橄榄中代谢物的组成和含量差异显著。多酚和黄酮类化合物有抗氧化、抗癌、抗肿瘤、抗心血管等功能[4， 15]，统计学分析结果显示，青橄榄和乌橄榄品种间，差异最为明显的物质集中在多酚和黄酮物质，这些物质在二者含量比率较大。其中奎尼酸、槲皮苷、鞣花酸在区分2个品种中的贡献最大。氨基酸作为橄榄果实重要营养物质及风味组成成分，其比例和种类是作为评价植物品质优劣的主要指标之一。不同的氨基酸其风味不同，其中丝氨酸和谷氨酰胺为甜味氨基酸，谷氨酸和苯丙氨酸为鲜味氨基酸，氨基酸在2种橄榄中都较为丰富，但不同品种氨基酸含量有所差别，是造成二者鲜食口感差异的重要因素[16]。此外，研究发现乌橄榄明显区别于青橄榄的独特的芳香气味是由对聚伞花素等烯萜类造成，而且乌橄榄油脂含量明显高于青橄榄，更适合作为开发橄榄油等相关产品的基础原料。因此，根据这些活性物质成分和含量开发相应保健產品，可大幅度提高橄榄功能性成分的生物利用度。

目前，对于橄榄代谢物研究多数采用靶向代谢组学技术，主要集中在特定一类化合物如多酚物质的研究上[9-12]，本研究采用非靶向代谢组学策略，无偏向性的检测样品内源性代谢物差异，由单独目标物或者已知一类物质的检测向全面信息检测转变，可获得更多更丰富的代谢物信息。本研究利用高分辨质谱，可一次提取进样同时筛查出氨基酸、多酚、黄酮、生物碱及油脂和芳香性气味等，方法快速高效。非靶向代谢组学策略在背景知识有限的情况下，对样品进行系统鉴定分析，获取大量代谢物数据，对于寻找差异代谢物和生物标志物具有独特优势。

由于鲜食橄榄地域性消费较突出，而现有蜜饯产品开发工艺多数停留在初加工且对橄榄中生物活性成分破坏较大，造成药用资源浪费。不同的加工过程会导致氧化和水解反应，从而使橄榄利用价值降低，因此，根据不同品种橄榄的代谢物差异从而选择特定的加工过程，对于充分有效利用橄榄资源至关重要[17]。此外，不同的地理环境和生长气候可能对橄榄化学成分比例产生重大影响，这些将直接影响橄榄的口感、风味和生物活性物质。本研究通过非靶向代谢组学分析不同产地和不同品种橄榄化学成分，为橄榄植物资源合理利用及相关产品深度开发提供试验依据，从而提高橄榄产品的附加值，拓宽橄榄市场。

4  结论

橄榄作为一种特色药食两用农产品，在我国资源丰富，具有可观的开发利用前景。本研究建立一种非靶向代谢组学分析方法用于不同品种橄榄的化学成分分析，利用统计学分析筛选出显著差异代谢物并进行了初步鉴定。研究表明，橄榄样品含有丰富生物活性物质，其中不同品种代谢物差异主要是酚酸类、黄酮类、氨基酸和脂质类化合物。目前，我国橄榄加工尚处于初步阶段，如何科学合理地开发利用橄榄资源，研发丰富多样的橄榄产品有待大量科技投入。本研究可为橄榄植物资源合理利用及相关产品深度开发提供依据。

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責任编辑：黄东杰