黄宁波， 高文卫， 梁 军， 朱 萌， 赵 仁

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004； 2.宁夏医科大学药学院，银川 750004；3.宁夏医科大学总医院，银川 750004）

淋巴瘤是免疫系统恶性肿瘤之一，儿童淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）最为常见，具有恶性程度高、临床分期晚、全身播散广、侵袭性强、结外侵犯多、耐药性强等特点。近年来，随着传统化疗方案的不断完善和造血干细胞移植技术的逐渐成熟，以及多种肿瘤靶向药物的应用，儿童NHL 在得到正确的分子分型之后，其5年无事件存活率提高至70%～90%[1]。造成患儿治疗失败、进展和复发最主要的原因是化疗耐药和药物耐受，因此寻找新的化疗药物和分子靶点是改善CHL 患儿预后、开展个体化治疗的关键因素。研究发现，第10 染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白酶（phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN）基因在多种肿瘤如子宫内膜癌、卵巢癌、成人淋巴瘤中均存在失表达或缺失，能调控多种信号通路发挥促凋亡、影响肿瘤血管生成、抑制增殖等抑癌作用[2-3]。Ki-67 属于核抗原，凡进入增殖周期的细胞都具有此DNA 复制时所需的蛋白，故被临床作为评估肿瘤细胞增殖活性的良好指标之一[4]。本研究采用免疫组织化学（SP 法）检测PTEN、Ki-67 在儿童NHL 中的表达情况，并结合患儿的临床病理特征进行相关性分析，旨在了解二者与儿童NHL 发生发展的关系，为临床NHL 的诊断、预后判断及靶向治疗提供实验依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月至2017年12月在宁夏医科大学总医院接受手术切除并经病理确诊的42例NHL 患儿为观察组，其中男性28例，女性14例，年龄1～14 岁，平均年龄（7.79±1.22）岁，≤7岁者16例，＞7 岁者26例；细胞类型：T 细胞型23例（间变大细胞型8例，T 淋巴母细胞型7例，未分型8例），B 细胞型19例（B 淋巴母细胞型4例，Burkitt 细胞型9例，弥漫性大B 细胞型4例，未分型2例）；血清乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平：正常（80～250 U·L-1）14例，增高（＞250 U·L-1）28例。临床分期：Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期35例。另选取同期接受手术切除治疗的淋巴结反应性增生（lymph node reactive hyperplasia，RH）患儿42例为对照组，其中男性30例，女性12例；年龄1～14 岁，平均年龄（7.73±1.18）岁。两组患儿均为首次进行手术治疗，且术前未接受化学及放射治疗。两组患儿年龄、性别差异均无统计学意义（P均＞0.05）。本研究经宁夏医科大学总医院伦理委员会审核批准。

1.2 临床病理资料

包括患儿性别、年龄、免疫分型、全身症状（包括发热、消瘦、盗汗、瘙痒等）、首发部位、结外受累、LDH、临床分期、国际预后指数（international prognostic index，IPI）等，其中IPI 用于评价患者预后，评价标准如下：根据进展性淋巴瘤发展，IPI 适用于全部类型淋巴瘤，可作为淋巴瘤治疗反应、复发、生存情况的一个预后评估因子。根据下列选项判断得分，每个特点1 分：年龄＞60 岁，分期为Ⅲ期或Ⅳ期，≥2 个结节外病变，全身状态评分≥2 分，血清LDH 表达升高。根据得分将患者分为4 个不同预后危险程度的组群：0 或1分为低度危险，2 分为低中度危险，3 分为中高度危险，4 或5 分为高度危险[5]。将其中低度危险与低中度危险者合为低度危险，中高度危险与高度危险者合为高度危险。

1.3 免疫组织化学（SP 法）

采用SP 法对两组石蜡包埋组织标本进行PTEN、Ki-67 染色。切片厚度4 μm，每个蜡块切取2 张，置于电热恒温培养箱（60℃～70 ℃）烤片24 h。次日切片用二甲苯脱蜡3 次，每次15 min，无水乙醇浸泡2 次，每次10 min，并依次放入浓度为95%、80%、70%的乙醇溶液，各5 min，流水冲洗后再用磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）液（pH=7.4）冲洗3 次，每次3 min。高压锅热修复，将切片置于1 mM 柠檬酸缓冲液（pH=6.0）中，100 ℃煮沸2 min，取出后流水冲洗，再用PBS 液冲洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，加3%的H2O2室温下避光孵育10 min，PBS 液冲洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，滴加一抗工作液，4 ℃过夜孵育。次日取出用PBS 液冲洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，滴加二抗工作液，室温孵育30 min，PBS 液冲洗3次，每次3 min。滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，镜下观察着色后流水冲洗2 次，加苏木素复染10～20 s，PBS 返蓝后流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.4 结果判断

阴性对照采用PBS 代替一抗，并用已知阳性表达的NHL 标本作为阳性对照。采用OLYMPUS公司的光学显微镜对标本进行观察。PTEN 以细胞质、胞浆或/和细胞核内有棕黄色颗粒呈现为阳性，Ki-67 以细胞核内有棕黄色颗粒呈现为阳性。根据染色强度和阳性细胞率判断特异性免疫反应强度，阴性（-）：阳性细胞＜0.5%；弱阳性（+）：阳性细胞数5%～25%，胞浆内浅棕黄色反应均匀分布；中度阳性（++）：阳性细胞数25%～50%，胞浆内均匀分布深棕黄色颗粒；强阳性（+++）：阳性细胞数＞50%，胞浆内呈棕黑色反应。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件对实验数据进行分析，计数资料采用例数及率（%）表示，PTEN、Ki-67表达与NHL 患儿临床病理因素的关系采用χ2检验及Fisher 确切概率法，PTEN 与Ki-67 表达的相关性分析采用双变量Pearson 相关性检验，PTEN、Ki-67 表达检测用于MHL 患儿的一致性分析采用交叉表Kappa 一致性检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PTEN、Ki-67 在NHL、RH 中的表达情况

PTEN 在NHL 患儿组织中，可见阳性细胞分布范围更广，染色着色程度更强；在RH 患儿组织中，虽有阳性细胞分布，但阳性细胞分布情况不及NHL 患儿组织，且染色着色强度相对弱。Ki-67 在NHL 患者组织中，可见细胞着色染色程度更强，染色范围更广，阳性细胞着色数目更多；在RH 患儿组织中，可见细胞着色染色程度不及NHL 患者组织，阳性细胞着色数目较少，见图1。观察组中PTEN 和Ki-67 在NHL 阳性表达率均高于对照组（P均＜0.05），见表1。

表1 PTEN 与Ki-67 在RH 和NHL 组织中的表达比较［例（%）］

2.2 PTEN、Ki-67 表达与NHL 患儿临床病理因素的关系

PTEN、Ki-67 在不同水平LDH 患儿中的阳性表达率不同，PTEN 在LDH 正常者中表达率高，而Ki-67 在LDH 增高者中表达率高（P均＜0.05）；PTEN、Ki-67 在不同IPI 危象度分级患儿中的阳性表达率亦不相同，PTEN 在IPI 低度危险者中表达率高，而Ki-67 在IPI 高度危险者中表达率高（P均＜0.05）。不同性别、年龄、免疫分型、全身症状、首发部位、结外受累、临床分期NHL 患儿PTEN、Ki-67 表达差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表2。

表2 PTEN 和Ki-67 表达与NHL 患儿临床病理因素的关系［例（%）］

2.3 NHL 组织中PTEN 与Ki-67 表达的关系

NHL 组织中26例Ki-67 阳性者，检出PTEN阳性17例（65.38%），阴性9例（34.62%）；16例Ki-67 阴性者，检出PTEN 阳性3例（18.75%），阴性13例（81.25%）。采用Person 相关分析，NHL 组织中PTEN 与Ki-67 表达水平呈负相关（r=-0.645，P＜0.001），二者在NHL 组织中检测的一致性好（Kappa 值=0.4325，P=0.003）。

3 讨论

儿童非霍奇金淋巴瘤包括高度成熟的B 细胞淋巴瘤［伯基特淋巴瘤（BL）、弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL）、原发性纵隔大B 细胞淋巴瘤（PMLBCL）、间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）和淋巴母细胞性T 细胞淋巴瘤（LL）[6]。不同病理类型的NHL预后不尽相同。总体来说，新型生物制剂，如分子靶向药物是改善NHL 患儿预后，提高长期无进展存活率的重要因素。在不增加药物后期效应的情况下研究NHL 相关分子表达的异常是开展分子靶向治疗的前提和基础，也为更精确地个体化治疗提供更理想的生物标记物。本研究中着重探讨两个重要指标PTEN 和Ki-67 在NHL 病理组织中的表达，以及二者的相关性和预后价值，评估其作为生物标志物对NHL 疾病进展预测和分子靶点的潜力。

PTEN 基因在肿瘤中有不同程度的突变缺失，与肿瘤的发生进展及预后不良密切关系，其具有蛋白磷酸酶与脂质磷酸酶两种活性，属抑癌基因，可经多种途径如MAPK、PI3K/Akt 信号通路等调控细胞的增殖分化、生长凋亡及聚集黏附等[6-7]。研究显示，PTEN 基因主要通过：（1）激活PI3K/Akt 通路，引起细胞体积增大、肿瘤血管生成、分裂增加、凋亡阻滞等[8]；（2）抑制FAK/P130C 磷酸化，下调整合素信号传递，抑制肿瘤细胞的侵袭、扩散[9-10]；（3）促进细胞自噬；（4）激活PI3K-AKT-MAM 途径，当PTEN 表达缺失时可造成T 细胞过度增殖，可能在NHL 的发生发展中发挥重要的作用。本研究检测PTEN在NHL 患儿淋巴结组织中的表达，并与同期RH 淋巴结进行比较，显示PTEN 的表达水平异常，两者相比差异有统计学意义。但本组标本中PTEN 在NHL组织中的阳性表达率高于RH 组，造成这种偏差的原因可能与入组病例数、分子分型比例、检测方法、检测试剂等因素有关。后期仍需要扩大样本量，严格入组筛选标准，利用多重检验方法等进一步考察PTEN 的差异性表达。PTEN 表达与NHL 患儿临床病理因素的分析显示，NHL 中PTEN 表达与LDH 水平、IPI 危象度分级存在相关关系，提示PTEN 基因异常表达与NHL 患儿体内肿瘤负荷、恶性转化细胞数、肿瘤进展、预后不良等存在密切关系。

Ki-67 是一种与细胞分裂增殖有关的核蛋白，其表达量随细胞周期不同而发生改变，是目前应用最广泛的细胞增殖标记之一。肿瘤属细胞周期性疾病，在其发生发展过程中，细胞周期的失控发挥着重要的作用。细胞周期是一种受到严格调控、有序且复杂的过程，细胞能经G2/M 期限制点和G1/S 期限制点确保细胞的忠实复制[11-12]。在细胞癌变过程中，细胞周期调控机制的失活，尤其是G2/M 期限制点和G1/S 期限制点出现突变[13-14]。Ki-67 是G2、M、G1、S 期细胞的标志蛋白，G0 期无表达。本研究中，Ki-67 在NHL 中阳性表达率明显升高，且与LDH 水平、IPI 危象度分级存在相关性，提示Ki-67 基因表达异常参与并可能促进NHL 的发生和进展，并提示预后不良。与临床分期的比较显示，Ki-67 在Ⅲ～Ⅳ期人群中阳性表达率为65.71%，高于Ⅰ～Ⅱ期人群的42.86%，统计学分析差异无统计学意义，但不完全排除Ki-67 与肿瘤进展的正相关。至少说明Ki-67 对儿童NHL 的分子分型、组织分级具有一定参考价值。一致性比较显示，NHL 组织中PTEN与Ki-67 表达水平呈负相关，二者用于NHL早期评估一致性好。

综上所述，PTEN、Ki-67 在NHL 患儿中存在显著异常表达，其阳性表达与NHL 患儿血LDH水平和IPI 危象度分层相关，联合检测PTEN、Ki-67 有助于判断临床治疗效果、预后评估，具有作为分子标志物和分子靶点的潜在可能性。