潘维扬，顾宗英，葛晓春

(1.复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200438；2.复旦大学 遗传工程国家重点实验室，上海 200438)

多聚ADP核糖化是一种蛋白质翻译后修饰，有两类酶参与该修饰过程：一类是负责修饰的多聚ADP核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase,PARP)；另一类则是负责去修饰的多聚ADP核糖水解酶(poly(ADP-ribose) glycohydrolase,PARG)[1].PARP可被DNA损伤激活，然后以NAD+为底物，将ADP核糖基团连接到靶蛋白的谷氨酸、赖氨酸或天冬氨酸残基上，经过多次催化，可以形成长达几百个ADP核糖基团的长链，即多聚ADP核糖(poly(ADP-ribose),PAR)链[2].依赖PAR链，PARP可募集多个互作蛋白，共同参与DNA的损伤修复；但PAR如果产生过量，则会过多消耗细胞内的NAD+分子，导致细胞能量衰竭，从而激活程序性死亡途径[3]，因此适量的PAR是DNA损伤修复信号，而过量的PAR则是细胞凋亡信号[4].PARG是PARP的逆反应酶，负责将多聚ADP核糖从被修饰的蛋白质上水解下来，使蛋白质恢复到原来的状态[1,5].

在动物中发现的可被多聚ADP核糖化修饰的底物包括：PARP本身、组蛋白、肿瘤抑制因子p53和DNA修复相关蛋白等[5]，这些被修饰的蛋白参与了DNA损伤响应、转录延伸、染色质重塑和RNA剪接等过程[6].植物中发现被多聚ADP核糖化修饰的底物包括组蛋白H1、H2A和H2B[7-8]，但最主要的还是PARP1和PARP2自身[9]，近年来还发现与植物免疫相关的蛋白DAWDLE(DDL)也可被多聚ADP核糖化修饰[10].

拟南芥中有3个PARP基因(PARP1，PARP2，PARP3)和2个PARG基因(PARG1，PARG2)[11]，这3个PARP基因的功能有所分化，其中PARP1和PARP2具有多聚ADP核糖化修饰活性，与DNA损伤修复有关，PARP1和PARP2突变后植物对基因毒剂的耐受性下降[12]；PARP3没有多聚ADP核糖化修饰活性，但它突变后种子的贮存寿命缩短，目前它参与的分子生物学过程尚不清楚[12-13].两个PARG基因中，PARG1起主要作用，PARG1的突变体parg1-4对诱导DNA损伤的基因毒剂异常敏感，表现为叶原基及根尖生长点处的细胞分裂严重受阻，真叶和根的生长发育减慢，死亡细胞明显增多，进一步的研究发现在突变体的根及叶片中积累了大量的PAR；PARG2基因的突变体与野生型相比没有明显的表型，表明在DNA损伤的情况下，PARG1确实是负责体内PAR降解的主要水解酶[14].

PARP1和PARP2除了受DNA损伤的诱导外，还受γ射线和活性氧的诱导[15]，拟南芥中PARP1和PARP2突变后，植株对干旱胁迫、强光胁迫和热胁迫的耐受性增强，其表型与体内PAR水平的降低有关[3]；PARP3只在种子中高量表达，在苗期表达水平很低，但强光、甲基紫精和高盐也可以诱导苗期PARP3表达量升高[16]；拟南芥接种病原菌后体内PAR水平显著提升，PARP抑制剂3-AB可以抑制植物对病原菌中的MAMPs(Microbe-Associated Molecular Patterns)的免疫反应[17].另外，在大豆培养细胞中还发现：过量表达AtPARP2在低ROS(Reactive Oxygen Species)浓度下对细胞具有保护作用，但在高ROS浓度下会加剧细胞死亡[18].PARP抑制剂有效地防止了氧化胁迫和热胁迫诱导的大豆和烟草细胞程序性细胞死亡[19].植物体内PARP的激活尽管对DNA损伤修复有利，但在逆境下过度激活则会大量消耗能量物质，从而导致细胞死亡.因此，PAR的稳态必须受到严格调控[20].

由于parg1突变体中PAR大量积累，且对基因毒剂异常敏感，为了进一步阐明PARP家族中各个成员与parg1突变体表型之间的关系，本研究通过杂交获得了拟南芥PARP2和PARG1的双突变体parp2-3parg1-4(简称p2g1)，通过表型观察并结合分子生物学手段，分析了PARP2突变对parg1-4体内PAR水平、DNA损伤响应以及一些与调控细胞死亡有关的基因表达水平的影响，从而为了解PARP家族各个成员的体内活性和功能提供了基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料与生长条件

本文所用的拟南芥(Arabidopsisthaliana)为Columbia生态型(Col-0)，突变体均为T-DNA插入突变体，这些突变体的相关信息可参考已发表文章[12,14].拟南芥种植在营养土(m黑土∶m蛭石∶m珍珠岩=9∶3∶1)中或1/2MS培养基上，培养条件为22℃，长日照(16h光照/8h黑暗).

种子经70%乙醇消毒10min后，再用100%乙醇洗涤，然后置于灭菌滤纸上晾干，用灭菌牙签点种到1/2MS培养基上或直接撒于营养土中，4℃低温层积化2d后放入温室或植物生长箱中培养.

对于需要用基因毒剂处理然后观察表型的材料，则将种子直接播种在含有100μg/mL博来霉素(zeocin)或者含有60μg/mL甲基磺酸甲酯(MMS)的平板上，2周后拍照和测量生长指标.

1.2 方法

1.2.1 植物总蛋白的提取

用液氮研磨拟南芥幼苗，加适量裂解液(5% 1mol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，1% 0.5mol/L MgCl2，10% 1mol/L NaCl，0.1% NP40，按1∶50加入蛋白酶抑制剂，1∶500加入1mmol/L DTT)，轻轻混匀后于冰上浸提5min，然后13000g，4℃离心10min取上清，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液于100℃金属浴煮12min，再13000g室温离心5min取上清.

1.2.2 Western blot

加蛋白样品于SDS-PAGE胶中，恒压120V电泳，根据目的条带大小控制电泳时间.电泳结束后，用去离子水冲洗SDS-PAGE胶，然后恒流300mA转硝酸纤维素膜，转膜结束后，用5%脱脂牛奶室温封闭膜2h，再加入一抗室温孵育1h，TBST(NaCl 8.8g/L，1mol/L Tris-HCl pH8.0 20mL/L，Tween-20500μL/L)洗膜3次，每次8min；二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次8min，最后用显色试剂在显色仪下显色.所用抗体为：一抗为Anti-pan-ADP-ribose binding reagent(Millipore)和β-tubulin(Abiocode)；二抗为Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated(康为世纪)或者Goat Anti-Mouse IgG，HRP Conjugated(Abiocode).

1.2.3 植物杂交

选择parp2-3未开放的花作为母本，用镊子去除花萼、花瓣和雄蕊，留下柱头，选择parg1-4已经完全开放的花作为父本，用镊子取下雄蕊柄部，在母本柱头上轻轻擦拭数次，做好标记.2～3d后，如果柱头伸长，则表明杂交成功.

1.2.4 双突变体的鉴定

选择杂交F2代的单株植物叶片鉴定，先用CTAB法提取DNA，再利用表1中的引物进行PARP2和PARG1基因鉴定，若基因型为野生型，则只有LP+RP能扩增出条带；若基因型为纯合突变，则只有RP+LB能扩增出条带；若基因型为杂合子，则LP+RP和RP+LB都能扩增出条带.

表1 双突变体鉴定引物序列Tab.1 Primers for identifying double mutants

1.2.5 叶绿素含量测定

先称量拟南芥幼苗鲜重，接着用液氮研磨材料，再加提取液(V丙酮∶V无水乙醇=95∶5)提取叶绿素，9000g离心10min后取上清，利用紫外分光光度计测量A645和A663，根据下列公式计算叶绿素含量：

叶绿素浓度Ct=8.02A663+20.21A645，

叶绿素含量(mg/g)=(Ct×提取液体积×稀释倍数)/样品鲜重

1.2.6 实时荧光定量PCR

在1/2 MS平板上生长10d的Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1幼苗，分别用200μg/mL zeocin和MMS处理，并于0、6、12、24、48h 5个时间点取材.利用TRIzol试剂(TaKaRa)抽提苗的总RNA，然后用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser试剂盒(TaKaRa)将RNA反转录成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR).目的基因相对Ubiquitin5(UBI)基因的表达量通过2-ΔΔCt公式进行计算，所用引物序列见表2.

表2 定量PCR引物序列Tab.2 Primers for Quantitative Real-time PCR

检测的DNA损伤响应和细胞死亡有关基因如下：多聚ADP核糖化聚合酶1(poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1)基因，γ反应抑制因子1(suppressor of gamma response 1,SOG1)基因，1型乳腺癌(breast cancer type 1,BRCA1)基因，精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1(metacaspase 1,MC1)基因和精氨酸/赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶8(metacaspase 8,MC8)基因.

2 结果与分析

2.1 双突变体p2g1在zeocin和MMS处理下的表型分析

PAR由PARP酶产生，为了解析PARP家族成员中的PARP2与parg1-4表型的关系，我们通过杂交构建了parp2-3和parg1-4的双突变体，简称p2g1，观察PARP2的突变是否可以恢复parg1-4的表型.zeocin可造成DNA双链断裂和诱导细胞死亡[21].正常条件下，Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1的生长状况基本相同，但在含100μg/mL zeocin的平板上，与Col-0相比，parp2-3叶片略黄，parg1-4植株小且叶片发黄，双突变体p2g1并未呈现类似parg1-4的表型，而是更接近于单突变体parp2-3(图1(a)和(b)).通过测定鲜重(图1(c))，我们发现在zeocin处理下，只有parg1-4与Col-0相比有显著性差异.通过叶绿素含量测定(图1(d))发现：p2g1的叶绿素含量高于parg1-4，而接近于parp2-3.以上结果说明PARP2突变可以部分恢复parg1-4在zeocin处理下叶片发黄死亡的表型.我们又将Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1同时点种于1/2MS平板和含 60μg/mL MMS的平板上，MMS是一种烷化剂，主要造成DNA单链断裂[22].经过反复试验，发现在含60μg/mL MMS的平板上，各突变体的表型差异最大.正常条件下，Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1生长2周后表型相似，但在60μg/mL MMS处理下，与Col-0相比，parp2-3表现敏感，根长略短，parg1-4植株小且根长极短，而双突变体p2g1生长状态明显好于parg1-4(图2(a)和(b))，接近parp2-3.通过测定鲜重和根长(图2(c)和(d))，发现在MMS处理条件下，parg1-4与Col-0相比有极显著性差异，p2g1表型介于parp2-3和parg1-4之间，说明PARP2突变可以部分恢复parg1-4对MMS敏感的表型，使得植物在MMS平板上生长状态更好.

2.2 parp2-3和parg1-4单/双突变体中PAR的水平分析

利用zeocin和MMS分别处理Col-0、parp2-3、parg1-4和p2g1幼苗，于24h和48h取样，通过Western blot检测体内的PAR水平(图3，见第708页).结果发现：在没有基因毒剂处理时，体内检测不到PAR信号；在基因毒剂处理下，随着胁迫时间的延长，PAR水平呈升高趋势.

在zeocin处理下(图3(a))，所有突变体中parg1-4的PAR信号最强，其他突变体中的PAR信号都远低于parg1-4；在parg1-4中，PAR信号从70kDa到接近胶孔位置都有分布，说明产生了巨大分子量的PAR链，而Col-0的PAR信号与parg1-4相比不仅弱，且分子量主要分布在130kDa到250kDa区间，parp2-3中的PAR信号比野生型弱，说明PARP2对植物细胞内PAR的产生有贡献；双突变体p2g1的PAR信号上升快，但也与Col-0一样，未出现较多的长PAR修饰链，总体来说，p2g1中的PAR信号强度远低于parg1-4，但强于parp2-3，现存的信号可能由PARP家族另外的成员，比如说PARP1产生.

在MMS处理下(图3(b))，parg1-4中的PAR信号也比其他遗传材料中的PAR信号强，链长从低到高都有分布，但强度远远低于zeocin处理后的信号强度，说明单链DNA损伤诱导产生PAR的能力较双链DNA损伤弱.24h时Col-0和parp2-3几乎没有PAR信号，而双突变体p2g1中仅出现微弱的PAR信号，48h时双突变体p2g1中的信号也远低于parg1-4，接近于parp2-3，说明p2g1较parg1-4降低的PAR信号主要是由PARP2贡献的.

2.3 zeocin和MMS处理下单/双突变体中DNA损伤与死亡响应基因的表达水平比较

与parg1-4相比，p2g1双突变体对基因毒剂敏感的表型得到了部分恢复，为了探究它的DNA损伤反应和细胞死亡响应是否也恢复到正常，我们选取了一些DNA损伤和细胞死亡响应过程中的关键基因，通过实时荧光定量PCR来检测它们的表达量(图4).

结果发现，在zeocin处理下，从0h到6h，响应DNA损伤的基因PARP1、SOG1和BRCA1的表达量在4种基因型的植物中都呈上升状态，6h时在parg1-4中的表达量明显高于其他3种基因型的植物，且到达表达高峰；从0h到12h，正调控细胞死亡的基因MC1在parg1-4中呈上升趋势，12h后稳定保持在较高的表达水平；48h时，正调控细胞死亡的基因MC8在parg1-4的表达量也明显高于其他3种植物.在双突变体p2g1中，这些基因表达的上升趋势被抑制，DNA损伤响应以及细胞死亡基因的表达水平均低于parg1-4，而更接近于parp2-3，与表型一致.

用MMS处理突变体发现，从0h到12h，响应DNA损伤的基因PARP1、SOG1和BRCA1的表达量在4种基因型的植物中都呈上升状态，在12h时表达均到达高峰，但是在parg1-4中，这些基因的表达水平均是最高的，表明parg1-4仍然是对MMS最敏感的基因型，在p2g1突变体中，这些基因的表达水平更接近于parp2-3，而明显不同于parg1-4(图5).相较于zeocin处理，在4种植物中，上述DNA损伤响应基因表达峰值的到来均往后推迟了6h，这与MMS相对较弱的DNA损伤能力一致；从0h到48h，MC1和MC8在parg1-4中的表达呈现缓慢上升趋势，12h后明显高于其他3种基因型的植物，而在其他3种材料中这两个基因的表达量差别不大，且只有轻微的上调.以上结果说明：在MMS诱导的单链DNA损伤的情况下，尽管DNA损伤响应基因和细胞死亡标志性基因的表达在parg1-4中被上调，但在p2g1双突变体中，这种上调趋势被阻止.

3 讨 论

PARP可被断裂DNA激活，进行自我修饰后募集其他DNA损伤修复蛋白如XRCC1、KU70到损伤位点，一起参与DNA损伤修复[19].修复过程启动后，PAR被PARG很快降解，避免积累，但当体内DNA损伤持续存在或者修复受阻时，大量产生的PAR就成为了细胞凋亡的信号[4].研究表明：动物中过量的PAR会转移至细胞质基质中，与线粒体表面的凋亡诱导因子互作，促进AIF(apoptosis-inducing factor)大量释放，所以PAR大量积累会导致细胞凋亡[4]，因此，降解PAR的PARG在维持细胞内多聚ADP核糖化水平中至关重要.研究表明，小鼠中PARG敲除会导致胚胎致死[23]，果蝇中PARG功能缺失会造成神经细胞发育终止，这些可能都与PAR过度积累有关[24].

我们研究了PARP基因家族成员PARP2的突变对parg1-4表型的影响，发现双突变体p2g1部分恢复了parg1-4对双链断裂诱导剂zeocin和单链断裂诱导剂MMS敏感的表型.我们推测当PARG1突变后，可能由于PARP1或者PARP2产生的PAR不能及时被降解，从而导致了parg1-4对基因毒剂敏感，但是这些PAR究竟是由其中一个PARP产生，还是由它们共同产生，目前尚不清楚.Western blot结果显示：在zeocin和MMS处理下，parg1-4中PAR的信号很强，且链长分布范围广，从低到高都有，而双突变体p2g1中PAR的信号强度大大弱于parg1-4，一些分子量较大和较小的PAR信号消失了，这部分信号可能由PARP2贡献；而剩余的信号主要在130kDa到250kDa区间，这一部分信号可能由PARP2之外的PARP成员比如PARP1产生.p2g1双突变体表型的部分恢复，说明PARP1和PARP2都与parg1-4突变体中PAR的积累有关，被修饰蛋白质总体减少或者修饰水平的降低，更有利于植物的生存.PARP2的突变导致了PAR大大减少，从而减轻了parg1-4的死亡相关症状.

在zeocin处理下，p2g1中130kDa到250kDa区间修饰条带的信号强度略强于parp2-3，而弱于parg1-4，推测在p2g1和parp2-3体内这些PAR信号主要由PARP1产生，修饰的蛋白可能主要参与了DNA的修复.parg1-4中高强度的PAR信号则可能激发了细胞的死亡，因为从zeocin平板上的生长情况看，除parg1-4外，其他材料未在很短的时间内出现死亡表型.在MMS处理下，24h时p2g1中130kDa到250kDa区间修饰条带的信号强度略强于parp2-3，48h时二者信号强度接近，结合根长和鲜重的定量结果，p2g1并未完全恢复到与parp2-3一样的表型，说明在面临单链DNA断裂修复时，还有其他PARP比如PARP1也起了作用.p2g1比parp2-3略敏感、PAR水平略高的原因可能是由于在PARG1基因突变的背景下，PARP1产生的PAR也不能被及时降解，从而这部分PAR也有所积累.总之，在zeocin和MMS处理下，p2g1双突变体中的PAR信号强度都明显弱于parg1-4，长链PAR也减少，说明PAR的大量产生确实是parg1-4对基因毒剂异常敏感表型的原因，而双突变体中PAR水平明显降低使得其表型部分恢复.

当植物体内出现DNA损伤时，会激活一系列的DNA损伤响应基因的表达.其中PARP1能迅速识别DNA损伤位点，激活自我修饰活性，同时募集其他蛋白结合到损伤位点[25]，BRCA1是参与DNA修复和染色质重塑的一种抑癌因子，可被磷酸化的组蛋白变体γH2AX招募至损伤位点[26-27].PARP1和BRCA1都属于识别DNA损伤的初始反应因子；SOG1则是DNA损伤途径中重要的转录因子，它能启动细胞周期检验点、DNA修复及细胞死亡相关基因的转录[28].zeocin处理后，在所有基因型植物中，PARP1、BRCA1和SOG1在6h内基因表达量都有一个明显的上调，说明它们都迅速地响应了细胞内的DNA双链损伤，但是，在双突变体p2g1中，PARP1、BRCA1和SOG1的表达量都明显低于parg1-4，说明在parg1-4背景下，PARP2再次突变可使得parg1-4中损伤响应基因的表达量下降；在parp2-3单突变体中这些基因的表达水平也明显低于双突变体p2g1.这些结果表明：双突变体中DNA损伤反应可能不如单突变体parg1-4严重，而更接近于parp2-3单突变体和野生型.在MMS处理的情况下，这3个基因的表达峰值尽管比zeocin处理时滞后出现，但在p2g1双突变体中，它们的表达水平也同样更接近于parp2-3，而显著区别于parg1-4.这些数据也与植物所呈现出来的表型相一致.

Metacaspases是一类存在于植物、真菌和原生生物中的蛋白酶[29]，拟南芥的基因组中编码9个metacaspases[30]，其中MC1能正调控病原菌引起的细胞死亡[31]，MC8能被紫外线、H2O2和甲基紫精等氧化胁迫诱导表达上调，最终导致细胞程序性死亡[32].在zeocin和MMS胁迫后期，MC1和MC8在parg1-4中的表达量明显高于p2g1，它们在parp2-3和p2g1的表达量也较为接近.p2g1体内细胞死亡因子表达水平的降低，从分子水平上说明PARP2突变确实部分恢复了parg1-4对zeocin和MMS敏感的表型.

本研究的实验结果揭示了PARP2突变可部分恢复parg1-4对基因毒剂敏感的表型，其机理与PARP2突变降低了parg1-4体内PAR的水平和DNA损伤及细胞死亡响应基因的表达水平有关，这些结果为了解PARP家族成员PARP2的活性与parg1-4表型的关系提供了新的理论依据.