蒋锋利 黄茂 蔡松 任士杰 孙文丽 张晶 赵明镜 张立山

摘要 目的：基于“IPF患者存在肺絡干血”假说，观察大黄虫丸含药血清对TGF-β1诱导后A549细胞上皮-间充质转化（EMT）及Smad3，Collagen Ⅲ表达的影响，探讨其防治特发性肺纤维化（IPF）的作用机制。方法：正常培养并取对数生长期A549细胞，TGF-β1对其诱导48 h，电子显微镜下观察A549细胞的形态学变化;选择吡非尼酮（PFD）为阳性对照药，RT-PCR法检测EMT相关基因及Smad3 mRNA的表达;Western Blottingting法检测Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表达。结果：成功获取发生EMT的A549细胞;以α-SMA mRNA表达情况判断EMT程度由高到低依次为：模型组（M），大黄虫丸含药血清大剂量组（D），西药组（P），大黄虫丸含药血清中剂量组（Z），大黄虫丸含药血清小剂量组（X），空白对照组（K）;与M组比较，Z组，X组，P组中Collagen Ⅲ表达不同程度降低（P<0.05），且其在Z组与K组中表达差异无统计学意义（P>0.05）;与M组及K组比较，各观察组Smad3表达差异无统计学意义（P>0.05），但对其基因及磷酸化，即Smad3 mRNA及p-Smad3的表达有影响，且与M组比较，Z组，X组，P组中均不同程度降低（P<0.05），D组中表达虽低于M组，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：大黄虫丸对TGF-β1诱导后A549细胞发生EMT程度与Smad3 mRNA及Collagen Ⅲ的表达有影响，推测大黄虫丸对IPF的保护机制可能与不同程度阻断或逆转了TGF-β1/Smad3介导的EMT有关。

关键词 大黄虫丸;肺络干血;特发性肺纤维化;含药血清;上皮细胞-间充质转化;转化生长因子-β1;α-平滑肌肌动蛋白;Ⅲ型胶原蛋白

Abstract Objective：To observe the effects of Dahuang Zhechong Pills-containing serum on EMT and the expression of Smad3 and Collagen Ⅲ Protein in A549 cells after TGF-β1 induction based on the hypothesis of “the presence of pulmonary collateral hard blood in IPF patients”，and to explore its role in the prevention and treatment of idiopathic pulmonary fibrosis mechanism.Methods：Normally we grew and took A549 cells in logarithmic growth phase，TGF-β1 intervened for 48 h，observed the morphological changes of A549 cells under electron microscope; choosed pirfenidone as a positive control drug，RT-PCR method to detect the expression of EMT related genes and Smad3 mRNA; Western Blotting was used to detect the expression of Smad3，p-smad3，Collagen Ⅲ protein.Results：The A549 cells with EMT were successfully obtained; the degree of EMT was determined from α-SMA mRNA expression in order from high to low：model group（M），large-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（D），Western medicine group（P），middle-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（Z），little-dose group of Dahuang Zhechong Pills containing serum（X），blank control group（K）; Compared with M，the expression of Collagen Ⅲ in Z，X，and P decreased to varying degrees（P<0.05），and there was no difference in the expression of Z and K（P>0.05）; compared with M and K，there was no difference in the expression of Smad3 in each experimental group（P>0.05），but it had an effect on the expression of its genes and phosphorylation，that is，the expression of Smad3 mRNA and p-smad3.All of them decreased in different degrees（P<0.05）.Although the expression in D was lower than M，it was not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：Dahuang Zhechong Pills has the effect on EMT and the expression of Smad3 mRNA and Collagen Ⅲ in A549 cells after TGF-β1 induction.It is speculated that the protective mechanism of Dahuang Zhechong Pills on IPF may be related to the blocking or reversal of EMT mediated by TGF-β/Smad3 to varying degrees.

Keywords Dahuang Zhechong Pills; Pulmonary collateral hard blood; IPF; Drug-containing serum; EMT; TGF-β1; α-SMA; Collagen Ⅲ

中图分类号：R289.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.24.007

特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）是一种原因不明，慢性进展，致死性间质性肺病，隶属中医“肺痿”“肺痹”范畴，亦有医家将其归为“喘证”，病性为本虚标实。该病以间充质细胞聚集体和能表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），且能促进有丝分裂及细胞外基质（ECM）分泌增加的肌成纤维细胞构成的“成纤维细胞灶”为其病理特征[1]。武维屏，姜良铎为代表的中医肺病专家提出“肺系络病”理论，将其病机概括为“气虚血瘀，痰热互结，痹阻肺络”[2-3]。基于以上认识，我们提出“IPF患者存在肺络干血”的假说，认为“肺络干血是肺纤维化病因，细胞外基质沉积是干血实质”[4]。针对“干血”一证，张仲景治以“缓中补虚”之大黄虫丸，尤在泾将本方治法概括为“润以濡其干，虫以动其瘀，通以去其闭”，实为仲景治疗“干血”的三大法门。

前期实验中，我们证实大黄虫丸对博来霉素致IPF大鼠的保护作用可能通过抑制MMP-2的产生来实现[5]。本实验通过制备不同浓度大黄虫丸含药血清，正常培养并取对数生长期A549细胞进行实验，TGF-β1（5 ng/mL）对其诱导48 h，电子显微镜下观察A549细胞的形态学变化;选择吡非尼酮作为阳性对照药，RT-PCR法检测EMT相关基因及Smad3 mRNA的表达;Western Blotting法检测Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表达，以期探索大黄虫丸对IPF防治作用的更多内在机制，进一步丰富捜剔肺络法防治IPF的学术内涵。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与细胞 选取健康SD雄性大鼠60只，体质量250～300 g。由北京维通利华试验动物技术有限公司提供，SPF/VAF级，许可证号：SCXK（京）2016-0006。大鼠饲养环境，湿度为5%～10%，温度（22±2）℃，12 h/12 h光照/暗循环，可以自由获取食物和饮水。本实验通过北京中医药大学东直门医院伦理委员会审批（伦理审批号：19-34）。

人肺泡上皮A549细胞株（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，北京）。

1.1.2 药物 大黄虫丸（北京同仁堂，国药准字：Z11020002，批号：17013170）;注射用盐酸博来霉素（杭州瀚晖制药有限公司，国药准字：H20055883，批号：19033911）;吡非尼酮胶囊（北京康蒂尼药业，国药准字：H20133376，批号：190505）。

1.1.3 试剂与仪器 总RNA提取试剂盒（北京基谱生物，货号：GPQ1801），Smad3抗体（Abcam公司，美国，货号：ab40854），p-Smad3抗体（CST公司，美国，货号：9520），Ⅲ型胶原蛋白抗体（Proteintech公司，美国，货号：22734-1-AP），Actin抗体（Abcam公司，美国，货号：ab6276），山羊抗鼠IgG，HRP（Abcam公司，美國，货号：ab6789）。二氧化碳培养箱（SANYO公司，日本，型号：MC0175），离心机（Eppendorf公司，德国，型号：Centrifuge 5415D），倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：CKX41），荧光定量PCR仪（杭州博日科技，型号：9600Plus），分光光度计（Thermo scientific公司，美国，型号：GENESYSTM 50），温控摇床（海门其林贝尔，型号：TS-2000A），电泳仪（北京凯元信瑞，型号：PP-1150）。

1.2 方法

1.2.1 大黄虫丸含药血清的制备及保存 SD大鼠适应性喂养3 d后，参照卢磊等[6]方法制备含药血清。按人与动物等效剂量换算法，分别算得大黄虫丸大，中，小及吡非尼酮的给药剂量为1.8 g/（kg·d），0.9 g/（kg·d），0.45 g/（kg·d）及0.18 g/（kg·d），以上剂量分别各给10只SD大鼠灌服，1次/d，持续7 d。末次给药1 h后，3%戊巴比妥钠（0.15 mL/100 g）腹腔内麻醉，无菌条件腹主动脉取血，冰上静置2 h，4 ℃，3 000 r/min（离心半径13.5 cm）离心15 min取上清液，分装并标记，56 ℃灭活30 min，-80 ℃快速冻固保存，待用。剩余20只SD大鼠灌以等量等渗盐水，以同样方法制备空白血清并保存，待用。

1.2.2 实验分组与造模 实验分为空白对照组（K组），模型组（M组），西药组（P组），模型+大黄虫丸含药血清大剂量组（D组），模型+大黄虫丸含药血清中剂量组（Z），模型+大黄虫丸含药血清小剂量组（X组）。参照Hidenori Kasai等的方法复制IPF细胞模型[7]。收集对数生长期A549细胞，调整细胞悬液浓度至5×104/mL，每孔2.5 mL接种于6孔板，2组均设3个复孔，37 ℃，5%CO2条件下，培养24 h。换液，均加入无血清DMEM/F-12培养基2.5 mL，继续培养24 h。换液，K组每孔加入2.5 mL培养基，其余各组每孔加入2.5 mL相应含TGF-β1（5 ng/mL）及药物血清的培养基，继续培养48 h，倒置显微镜下观察并拍照。见图1。结合2.2中，M组与K组比较，E-cadherin mRNA表达显著降低（P<0.01），间充质标志α-SMA mRNA表达显著升高（P<0.01），表明IPF细胞模型成功[8]。

1.2.3 RT-PCR法检测EMT及Smad3相关基因表达 不同浓度大黄虫丸含药血清对TGF-β1诱导48 h后A549细胞表达上皮性钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA，α-SMA mRNA，Smad3 mRNA情况的影响。获取1.2.2中各观察组细胞，按总RNA提取试剂盒（DNaseⅠ）试剂盒说明提取细胞样本中总RNA并定量，1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测RNA的完整性。按mRNA cDNA合成试剂盒说明逆转录合成cDNA，-20 ℃保存备用。按mRNA/lncRNA qPCR试剂盒说明进行扩增，反应程序为95 ℃ 30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）×45个循环，同时在60～95 ℃进行融解曲线分析，采用2-△△Ct法进行数据的相对表达强度分析，所有样本均设3个重复。引物设计由北京基谱生物科技有限公司完成。见表1。

1.2.4 Western Blotting法检测Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表达

Western Blotting法检测不同浓度大黄虫丸含药血清对TGF-β1诱导48 h后A549细胞表达Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白情况的影响。重复1.2.2实验分组及细胞培养过程，获取TGF-β1诱导48 h后A549细胞。按蛋白质提取试剂盒（北京基谱生物，货号：GPP1815）说明进行蛋白提取，BCA法蛋白定量，依照电泳上样量需要用SDS-PAGE上样缓冲液（5×）调整蛋白浓度，100 ℃煮沸变性10 min备用。配制12%的分离胶，5%浓缩胶。算得待检测蛋白样品上样量60 μg，浓缩胶恒压80 V，约20 min;分离胶恒压120 V，电泳至溴酚蓝到凝胶底部。2 h恒流300 mA转膜至PVDF膜，5%BSA室温封闭1 h。将PVDF膜置于杂交袋中，分别加入配制好的一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，加入相应二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜3次，10 min/次。按ECL Plus Western Blotting Kit试剂盒说明暗室中曝光，显影并定影。

条带灰度值采用Quantity One v.4.6.2软件进行读取，除以内参Actin灰度值，即得样品中目标蛋白的相对表达量，所有样本均设3个重复。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，各组间差异用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 M组和K组组织学结果

M组中A549细胞经TGF-β1诱导48 h，形态逐渐由鹅卵石状变为伸长的纺锤形或梭形，细胞圆形度降低，与成纤维细胞，肌纤维母细胞形态相似。见图1。

2.3 各组Smad3，p-Smad3，Collagen Ⅲ蛋白表达   与K组比较，M组中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表达较K组显著增加（P<0.01），说明TGF-β1诱导48 h后的A549细胞核转录过程十分活跃。PFD处理后，与M组比较，P中Collagen Ⅲ、Smad3和p-Smad3的表达显著降低（P<0.05）。同样的，在D组、Z组和X组中也观察到这种现象。当剂量为0.45 g/（kg·d）时，则显示出较好的治疗效果。见图2，表3。

3 讨论

转化生长因子-β（TGF-β）是一种多功能细胞因子，具有促进细胞增殖，分化，凋亡及ECM形成等生物活性，被認为是诱导包括肺在内诸多脏器纤维化的“主开关”[9]。肺损伤的患者和动物的肺纤维化中已发现TGF-β1过表达[10-11]，且TGF-β1作为上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）诱导剂在包括肝脏，肾近端小管，晶体等上皮细胞中已被证实[12]。在IPF进展中，肺泡及气道上皮中均发现存在EMT，其中肺泡上皮细胞（AEC）是肺纤维化的主要致病介质[13]。α-SMA表达说明成纤维细胞分化为成肌纤维细胞，是ECM信号的来源，且这一过程促进了肺损伤的发展[14]。另外，α-SMA，I型胶原，Ⅲ型胶原，纤连蛋白及波形蛋白消融可减轻小鼠肺组织样本中的纤维化[15]。Smads是TGF-β超家族细胞内重要的信号转导和调节分子，该信号通路与人类诸多疾病的发生密切相关[16]。除Smads介导的细胞核转录外，TGF-β还可以激活包括促分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途径，Rho样GTPase信号转导途径及磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/AKT等多种信号途径来促使脏器纤维化[17]。

前期研究中证实，EMT可以被多种中药制剂阻断或逆转，表现出对IPF的保护。柴胡皂苷D可通过mTOR信号通路抑制A549细胞EMT，且呈明显的剂量-时间依赖关系[18]。姜黄素通过Wnt3a/β-catenin信号通路抑制EMT，从而阻断胃癌细胞（MKN45）的增殖，迁移及侵袭[19];姜黄素可逆转缺氧诱导的肝癌细胞（HepG2）增殖和迁移能力增加，可能与其抑制缺氧诱导的HIF1-α蛋白上调和EMT有关[20]。黄芩苷通过TGF-β/Smads信号转导途径减轻因辐射诱导Ⅱ型AEC发生的EMT[21]。穿心莲内酯通过TGF-β1介导的Smads依赖性和非依赖性途径抑制T细胞的增殖和成纤维细胞分化，从而改善了博莱霉素诱导的肺纤维化[22]。槲皮素通过增加E-cadherin表达，降低神经性钙黏蛋白（N-cadherin），波形蛋白（Vimentin）表达，使得TGF-β1诱导的肝癌细胞（SMMC-7721）EMT得到明显抑制[23]。白藜芦醇通过阻断TGF-β1/Smad3信号通路转导，抑制了TGF-β1诱导的人肺上皮细胞A549的增殖及上皮间质转化[24]。人参皂苷Rg1可能通过抑制EMT来改善COPD大鼠小气道纤维化[25]。黄芪甲苷可通过AKT/β-catenin信号通路抑制TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞（HMrSV5）EMT程度[26]。大黄素通过抑制TGF-β1/ADAMTS-1信号抑制肺成纤维细胞增殖及其EMT，并减少Ⅰ/Ⅲ型胶原合成[27]。

本研究中，E-cadherin mRNA表达降低与α-SMA mRNA表达升高为发生EMT的标志。如结果所示，α-SMA mRNA表达由高到低依次为：M组，D组，P组，Z组，X组，K组。与M组比较，除D组外其余组，作为间充质细胞标志α-SMA mRNA表达均显著降低（P<0.01），提示中小剂量大黄虫丸可显著改善TGF-β1诱导48 h后A549细胞EMT程度，且效果上X组优于P组（P>0.05）。作为衡量IPF程度的重要指标，亦是ECM重要成分的Collagen Ⅲ表达由高到低依次为：M组，D组，P组，Z组，X组，K组。本研究结果还提示大黄虫丸可不同程度抑制TGF-β1诱导48 h后A549细胞表达Smad3 mRNA及p-Smad3，且大体上与剂量呈负相关，进而影响TGF-β1/Smad3信号通路介导的EMT程度，起到抗纤维化作用，且此过程可能受到其他与EMT相关信号通路的影响，尚需进一步研究证实。此外，与M组比较，D组中表达α-SMA mRNA，Collagen Ⅲ虽不同程度降低，但均无差异（P>0.05），且E-cadherin mRNA的表达甚至为各用药组最低，即其抑制EMT效果最差。提示大黄虫丸对IPF的保护作用可呈双向性，剂量的选择是主要影响因素。

综上所述，TGF-β1/Smads信号通路在IPF的發生与进展中起重要作用，作为正向调节剂，磷酸化Smad3过表达可促进与TGF-β1信号密切相关的EMT发生。本研究结果表明，大黄虫丸对TGF-β1诱导后A549细胞发生EMT程度与Smad3基因及磷酸化的表达有影响，推测大黄虫丸对IPF的保护机制可能与不同程度阻断或逆转了TGF-β1/Smad3介导的EMT有关，为大黄虫丸可作为IPF患者的潜在有效治疗药物提供了更多科学依据。

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（2020-06-16收稿 责任编辑：张雄杰）