王玮尉 梁美霞 许庆文 徐飞鹏 林琳 黄哲 殷静雯

1广东医科大学附属医院胃肠外科，湛江524001；2广东医科大学附属医院，湛江524001通信作者：殷静雯，Email：amysays＠live.cn

0 引 言

胃癌是常见的恶性肿瘤，且恶性程度高、早期诊断困难、预后较差，对人类健康构成巨大威胁[1-2]。临床病理学分期难以在早期发现部分高风险的胃癌患者，如一些临床病理分期较早，但术后肿瘤复发或发生异时转移的胃癌患者。目前，随着对肿瘤发生发展的分子机制研究的深入，已证实基因的异质性对患者预后有重要影响[3]，为胃癌的诊治开辟了新的方向。

结肠癌转移相关基因1（metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1）是与胃肠道肿瘤密切相关的基因[4]。MACC1 高度表达于结肠癌和转移灶中[5]。研究结果表明，MACC1 基因位于罹患胃肠道肿瘤的风险区域（7p21.1），在胃肠道及消化系统肿瘤（如胃癌、肝癌、胰腺癌）中高表达[6-7]。临床研究结果表明，MACC1 是决定结肠癌转移的因子之一，远处转移的结肠癌患者在癌症发生初期MACC1 的表达已经显著增高。因此，组织中MACC1 的表达可能预示着肿瘤生物学行为向恶性转变，原发肿瘤可能会发生远处转移[7-9]。

有研究者指出，胃癌原发性病灶的MACC1 表达阳性率明显高于癌旁黏膜，并与胃癌生存期相关[10-11]。Shirahata 等[12]发现MACC1 在发生腹膜散播转移的胃癌中高表达。大量研究结果已经证实MACC1 与胃癌存在相关性。综上，MACC1 分子对于肿瘤患者的发病风险识别、诊断及预后预测都具有临床应用前景。本研究中，通过检测胃癌组织和血清中MACC1 的表达，分析血清中MACC1 水平对胃癌的诊断特征，以期为胃癌发现及诊断提供新的分子生物学指标。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择广东医学院附属医院胃肠外科于2011年6月至 2020年11月收治的 51 例经手术治疗的胃癌患者，其中男性35 例，女性16 例，年龄59.6±11.7 岁。收集患者的血清标本、胃癌组织标本、癌旁组织标本、正常胃黏膜标本及相应临床资料。纳入标准：患者在术前及术中均未进行化学治疗和放射治疗；经术前或术后病理证实为胃癌。胃癌的临床病理分期参照国际抗癌联盟的第5 版胃癌TNM（tumor-lymphnode-metastasis）分期法。本研究已经过广东医科大学附属医院机构审查伦理委员会批准，所有纳入患者均知情同意，并签署知情同意书。

1.2 主要材料与仪器

MACC1（D-15）抗体（sc-163595，美国 Santa Cruz公司），MACC1 酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（武汉优尔生科技股份有限公司），超敏即用型二步法（非生物素）检测试剂盒（PV-9003，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司），TS100-F相差倒置显微镜（日本Nikon 公司），Multiskan MK3酶标仪（德国Thermo Scientific 公司）。

1.3 方法

1.3.1 血样及标本采集

用血清分离管收集纳入胃癌患者的术前全血标本1 ml。血样在室温放置2 h 后，立即用1 000×g离心20 min，取上清放入EP 管，置于-80 ℃保存。于粤西地区临床病例资料库中，取40～70 岁正常人血清标本 30 例（男 15 例，女 15 例）作为阴性对照，且使用前置于-80 ℃保存。

收集胃癌患者离体0.5 h 内的新鲜胃癌组织标本、距癌组织2～2.5 cm 的癌旁组织和距癌组织大于5 cm 的胃癌正常组织。将新鲜组织标本立即放入体积分数为10%的福尔马林溶液中固定。

1.3.2 双抗体夹心ELISA 法检测血清MACC1 表达

采用双抗体夹心法检测血清中MACC1 的表达。测试前，将ELISA 试剂盒中的所有试剂、血清标本缓慢均衡至室温，所有标本均标上序号。稀释标准品（冻干品），按浓度高到低加入500 μl 标准品稀释液，依次稀释成 20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 ng/ml 标准液。稀释A、B 工作液，分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。标准孔有7 孔，依次加入100 μl 不同浓度的标准品；空白孔加 100 μl 标准品稀释液；分别将100 μl 肿瘤患者血清及阴性对照组血清加入待测样品孔中。酶标板加上覆膜，37 ℃温育2 h。弃去孔内液体，洗涤液洗涤，加B 工作液，弃去孔内液体。每孔加底物溶液50 μl，酶标板加上覆膜，37 ℃避光显色25 min。在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450 nm 波长下检测各孔的光密度值。

1.3.3 免疫组织化学染色

取正常黏膜组织、癌旁组织、胃癌组织，大小均约 1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm，以 1∶10 的体积比置于体积分数为10%的中性甲醛固定液中固定。用梯度乙醇溶液脱水后，用石蜡包埋。在石蜡切片机上，将组织蜡块切成4 μm 的薄片，用漂浮法将切片置于干净的载玻片上，将其放入烤片盒中，于60 ℃恒温箱内烤片25 min。然后用常规方法进行苏木素-伊红染色。

将正常黏膜、癌旁组织、胃癌组织石蜡切片进行水化。将切片浸入pH=6.0，0.01 M 的枸橼酸修复液中，微波炉加热进行抗原修复。用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤 3 次。滴加正常羊血清封闭液50 μl（A 液）封闭。滴加一抗稀释液（用 PBS 按 1∶50 稀释）后，4 ℃过夜。滴加辣根过氧化物标记山羊抗驴 IgG（B 液）50 μl，37 ℃ 孵育30 min。滴加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素（C 液）50 μl。用二氨联苯胺（diamio benzidine，DAB）显色，苏木素复染，蓝化，无水乙醇脱水。滴加中性树脂，封片后用相差倒置显微镜观察并拍照，拍照时保证显微镜光源亮度稳定、曝光时间一致。

应用 Image-Pro Plus（V6.0.0.260）图像处理分析软件对胃癌组织免疫组化图片进行定量分析，统计阳性表达的累积光密度（integrated optical density，IOD）和平均光密度（mean density）。对细胞膜、细胞核、胞浆中的棕色颗粒细胞进行分析，MACC1 蛋白阳性部位主要在胞浆。判断标准：低倍镜下选取MACC1 蛋白阳性细胞最密集区，再于100 倍镜下计数2～3 个视野中的细胞，在组织切片中显示胞浆染色为淡黄色至棕褐色为阳性标志，以阳性细胞占视野中细胞的百分数（%）来表示，阳性百分率≥20%为阳性表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0 统计学软件处理数据。计量资料采用均值±标准差（Mean±SD）表示，两组比较采用独立样本t 检验，三组比较采用方差分析，组间多重比较采用LSD-t（least significant difference-t）检验。计数资料用卡方检验，相关分析采用Pearson 相关性分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

采用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线评价诊断效力，采用约登指数（即敏感性+特异性-1）评估最佳临界值。

2 结 果

2.1 MACC1 在正常胃黏膜组织、癌旁组织、胃癌组织中的表达

正常胃黏膜组织、癌旁组织、胃癌组织的免疫组化染色图片如图1 所示。癌旁组织、胃癌组织的苏木素-伊红染色图片如图2 所示。MACC1 定位在胞浆。在正常胃黏膜组织中，MACC1 呈阴性表达或弱阳性表达，且在弱阳性表达组织中，阳性瘤细胞呈不规则小灶型分布。在癌旁组织中，MACC1 呈阴性表达或中阳性表达，且在中阳性表达组织中，阳性细胞呈腺管型分布。在胃癌组织中，MACC1 呈中阳性或强阳性表达，阳性细胞呈弥漫型。

图1 正常胃黏膜组织、癌旁组织、胃癌组织中结肠癌转移相关基因1（MACC1）的免疫组化染色图片（×400）

图2 癌旁组织、胃癌组织的苏木素-伊红染色图片（×400）

在所有51 例患者的组织标本中：正常胃黏膜组织中10 例MACC1 蛋白阳性表达，阳性率19.61%；癌旁组织中13 例阳性表达，阳性率25.49%；胃癌组织中26 例阳性表达，阳性率50.92%。（表1）

表1 结肠癌转移相关基因1（MACC1）在胃癌组织、癌旁组织、正常胃黏膜组织中的表达情况

2.2 MACC1 在胃癌患者血清中的表达

在30 例正常对照中，MACC1 的表达水平为（0．12±0．08）ng/ml，51 例胃癌患者中，MACC1 的表达水平为（0．20±0．13）ng/ml，两者差异有统计学意义（t＝3．18，P＝0．002）（图 3）。诊断测试 ROC 曲线表明，血清MACC1 对胃癌具有诊断效力，其曲线下面积（area under curve，AUC） 为 0.717，最佳临界值为0.38，相应的灵敏度为0.55，特异度为0.83（图4）。

图3 胃癌患者血清结肠癌转移相关基因1（MACC1）表达水平

图4 血清血清结肠癌转移相关基因1（MACC1）对胃癌的诊断测试ROC 曲线

2.3 MACC1 在胃癌组织及血清中表达的关系

在胃癌组织MACC1 阴性表达组中，患者血清MACC1 表达水平为（0.16±0.12）ng/ml；在胃癌组织MACC1 阳性表达组中，患者血清MACC1 表达水平为（0.24±0.13）ng/ml，两者差异有统计学意义（t=2.35，P=0.023）。进一步结合分析免疫组化结果，证实MACC1 在胃癌患者血清和胃癌组织中表达水平呈正相关关系（r=0.52，P＜0.01），如图 5 所示。

图5 胃癌患者组织与血清中结肠癌转移相关基因1（MACC1）水平的相关性分析

2.4 胃癌组织及血清MACC1 的表达与临床病理参数的关系

2.4.1 胃癌组织MACC1 低表达和高表达组患者的临床病理参数分析

对比分析了胃癌组织MACC1 低表达和高表达组患者的临床病理参数。临床病理参数包括：性别（男、女）、年龄（＜55 岁、≥55 岁）、肿瘤发生部位（贲门底部、胃体部、幽门中部）、病理类型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸润深度（T1～T4）、局部淋巴结转移情况（N0～N3）、远处转移情况（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、肿瘤最大直径（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。结果表明，胃癌组织MACC1 低表达和高表达组在上述病理参数方面的差异均无统计学意义，统计指标分别为：性别（χ2=0.49，P=0.49）、年龄（t=0.40，P=0.69）、肿瘤发生部位（χ2=1.08，P=0.58）、病理类型（χ2=0.27，P=0.61）、胃壁浸润深度（χ2=0.25，P=0.97）、局部淋巴结转移（χ2=1.21，P=0.75）、远处转移（χ2=0.18，P=0.52）、TNM 分期（χ2=1.08，P=0.78）、肿瘤最大直径（t=0.38，P=0.71）。

2.4.2 胃癌患者血清MACC1 低表达和高表达组患者的临床病理参数分析

对比分析了胃癌患者血清MACC1 低表达和高表达组患者的临床病理参数。临床病理参数包括：性别（男、女）、年龄（＜60 岁、≥60 岁）、肿瘤发生部位（贲门底部、胃体部、幽门中部）、病理类型（腺癌、非腺癌）、胃壁浸润深度（T1～T4）、局部淋巴结转移情况（N0～N3）、远处转移情况（是、否）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）、肿瘤最大直径（＜4.5 cm、≥4.5 cm）。

结果表明，胃癌患者血清MACC1 低表达和高表达组在上述病理参数方面的差异均无统计学意义，统计指标分别为：性别（t=0.88，P=0.38）、年龄（t=0.43，P=0.67）、肿瘤发生部位（F=0.45，P=0.64）、肿瘤类型（t=0.65，P=0.52）、胃壁浸润深度（F=0.74，P=0.54）、局部淋巴结转移（F=1.15，P=0.34）、远处转移（t=1.02，P=0.31）、TNM 分期（F=0.57，P=0.64）、肿瘤最大直径（t=1.62，P=0.11）。

3 讨论与结论

本研究结果表明，胃癌患者的血清MACC1 表达水平为（0.20±0.13）μg/ml，而正常对照组为（0.12±0.08），二者差异有统计学意义（P＜0.01）；对比癌旁组织和正常组织，胃癌组织中MACC1 表达明显升高（P＜0.01）；胃癌患者血清及胃癌组织中的MACC1表达水平呈正相关；胃癌患者MACC1 的表达水平与其临床病理参数（性别、年龄、肿瘤发生部位、肿瘤大小、病理分型、胃壁浸润深度、局部淋巴结转移、远处转移、TNM 分期）的关系均无统计学意义（均 P ＞0.05）。但胃癌患者血清和胃癌组织中MACC1 呈高表达，提示MACC1 与胃癌的发生关系密切，该结果与国内外其他研究结果相一致[13-14]。

MACC1 已被证明与肿瘤发生和肿瘤进展高度相关，并对胃癌患者的临床结局产生不利影响。关于MACC1 在胃癌中的作用机理，研究结果表明MACC1 可促进上皮向间充质转化并加速癌症转移。此外，MACC1 还参与了许多胃癌标志物的调控。MACC1 可能通过与MET 启动子结合后增强MET表达，从而调控HGF/MET 通路[4]。MET 蛋白是由原癌基因c-met 编码的人肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）的细胞膜特异性受体。HGF 是肝细胞内皮细胞分泌的多效生长因子。人胃癌细胞株中HGF 的表达在肿瘤细胞从G0、G1 期进入S 期时逐渐增高。HGF 与特异性MET 受体结合诱导下游信号系统，引起细胞增殖、黏膜上皮转化，促进血管生成，增强细胞运动，加强肿瘤细胞侵袭转移等。而MACC1 siRNA 能抑制细胞增殖和移动，减少体内转移，并使MET mRNA 和其蛋白的表达大大减少，抑制细胞移动和增殖[15]。MACC1 通过调控TWIST1/2促进血管生成，增加肿瘤的血液供应[16]。MACC1 还可通过上调血管内皮生长因子C/D（vascularendothelial growth factor C/D，VEGF-C/D）的细胞外分泌来促进胃癌淋巴管生成，这表明MACC1 可能参与胃癌的淋巴传播调控途径[17]。此外，MACC1 通过增强Warburg效应来支持代谢应激下的胃癌生长[18]。综上，MACC1参与胃癌细胞内部和外部的多个生物学过程，使其成为肿瘤微环境调控的重要因子。

本研究中，检测并对比正常人及胃癌患者血清中的MACC1 表达情况，发现MACC1 水平在胃癌患者血清中明显增高，这一发现有助于胃癌的辅助诊断及普查。本研究结果显示，胃癌患者血清及胃癌组织中的MACC1 表达水平呈正相关关系。因此，推测血清中的MACC1 的表达水平可能与胃癌患者发病、癌症的发展及预后有关。血清标本易于搜集，因此可能为胃癌患者诊断及预后判断提供生物学参考。血清及胃癌组织的MACC1 表达与患者的各项临床病理参数无关，这可能使MACC1 成为独立于TNM 的临床病理分期指标及预后的预测指标。因此，对MACC1 的研究能为胃癌的基因治疗提供了良好的前景。

综上所述，MACC1 水平与胃癌的发生、发展及预后存在高相关性，其可以作为胃癌诊断预测的参数，且有望成为胃癌治疗的新分子靶标。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突