王丹,刘静,陈勇，冯丹，姜蓉琼，杨桂钊，袁国华

川北医学院附属医院风湿免疫研究所,四川南充637000

类风湿关节炎(RA)是一种以侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病。目前RA的治疗药物主要包括非甾体抗炎药(NSAIDs)、改善病情抗风湿药(DMARDs)、糖皮质激素、生物制剂及JAK抑制剂等。在DMARDs中，甲氨蝶呤(MTX)为RA临床一线用药，常作为RA的起始治疗药物，尤其是对有侵袭性证据的RA患者，其可有效控制患者骨质破坏进展。近年来，许多针对RA的生物制剂得到广泛应用，但在无用药禁忌情况下，MTX为RA的首选药物，其可单独用药或与其他DMARDs联合用药[1-3]。虽然已知甲氨蝶呤具有最佳的成本效益和疗效/毒性比率，但其毒性作用仍不容忽视，多数患者由于甲氨蝶呤相关药物不良反应(ADRs)的发生而中断长期治疗[4]。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)为叶酸代谢途径中重要的转化酶，MTHFR在MTX作用机制途径(包括叶酸途径、蛋氨酸途径、嘌呤及嘧啶从头合成途径等[5])中意义重大。目前已有多项研究表明，MTX治疗结果与MTHFRC677T基因多态性有关[6-9]。为进一步探讨RA患者MTHFRC677T基因多态性与MTX相关ADRs的关系，本研究采用TaqMan荧光PCR技术检测MTHFR[677C>T (rs1801133)]的单核苷酸多态性(SNP)，并回顾患者使用MTX期间出现的相关ADRs，分析MTHFRC677T基因多态性与MTX不良反应的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2018年12月—2019年12月于川北医学院附属医院风湿免疫科就诊的RA患者178例，其中男24例、女154例，年龄18～75岁，患者均连续接受过MTX治疗，MTX剂量为每周5～20 mg，治疗持续至少4个月。入选患者均符合美国风湿病学会(ACR)和欧洲风湿病联盟(EULAR)2010年修订的RA分类标准，并排除感染、肿瘤、妊娠或母乳、其他慢性疾病及肝肾功能不全等因素。本研究遵循人体受试者道德伦理学标准，研究方案得到川北医学院伦理委员会批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 DNA提取 空腹抽取受试者外周静脉血2 mL置于EDTA-K2抗凝管中，取1 mL全血样本，用DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA，提取出的DNA样本使用Merinton仪器公司SMA4000微量分光光度计(Merinton Instrument, Inc)测量样本浓度及纯度，要求A260/A280在1.8～2.0，浓度大于20 ng/mL，测量完成的样本保存于-80 ℃冰箱，用于后续实验。

1.3 等位基因分型 用TaqMan荧光PCR方法检测MTHFR[677C>T (rs1801133)]的SNP。用Primer Premier 5.0软件设计PCR引物及TaqMan-MGB探针，PCR引物序列：正向引物5′-GCTGACCTGAAGCACTTGAAG-3′，反向引物5′-GAATGTGTCAGCCTCAAAGAAA-3′；TaqMan探针序列：FAM-TGAAATCGGCTCCC-MGB，VIC-TGAAATCGACTCCCG-MGB，C型为FAM标记，T型为VIC标记，MGB为小沟结合物。DNA样本稀释10倍后作为模板检测。PCR反应体系总体积为10 μL，2×TaqMan Fast qPCR Master Mix 5 μL，正向引物0.25 μL，反向引物0.25 μL，两种荧光探针各0.2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 3.1 μL。PCR反应条件：94 ℃反应3 min、94 ℃反应5 s、60 ℃反应30 s。PCR反应在LightCycler480型荧光定量PCR仪(Rotkreuz, Switzerland)上进行，反应结果表现为不同基因型发出不同的荧光：C型为FAM标记，蓝色荧光，表现为X型；T型为VIC标记，绿色荧光，表现Y型；杂合CT型，混合型，为红色荧光，表现为XY型。

1.4 不良反应观察 统计受试者MTX应用期间出现的MTX相关ADRs，包括胃肠黏膜反应(如口腔溃疡、反酸、恶心、呕吐、胃痛、胃溃疡、腹痛等)、血液系统损害(如白细胞减少、血小板减少等)、肝肾功能损害(转氨酶、肌酐、尿素氮等异常)、生殖系统(如月经异常)及其他(如头晕、脱发、口唇疱疹、肺间质病变等)。其中，血液系统损害定义为白细胞计数<3.5×109/L[(3.5～9.5)×109/L]和/或血小板计数<100×109/L[(100～300)×109/L]；肝功损害表现为转氨酶≥3倍正常值上限；肾功能损害表现为血尿素氮、肌酐大于正常值上限，尿常规出现隐血、尿蛋白，并排除生理及食源性因素影响。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。采用Hardy-Weinberg平衡法检测基因型间等位基因频率分布是否符合遗传平衡法则。不良反应的发生与各可能影响因素的关系研究采用Logistic回归分析。各基因型ADRs发生频率组间比较采用χ2检验，非正态分布的计量资料组间比较采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTX相关ADRs的发生率 178例受试者中，应用MTX治疗期间出现ADRs71例，包括胃肠道反应31例、血液系统毒性35例、肝毒性7例、肾毒性4例、生殖系统毒性6例、其他(脱发、头晕、肺间质病变等)7例，MTX相关ADRs的发生率为39.9%。31例发生胃肠道反应患者中，同时伴有血液系统毒性7例、肝毒性2例、生殖系统毒性1例、其他(脱发、头晕、肺间质病变等)3例。35例发生血液系统毒性患者中，同时伴有胃肠道反应7例、肝毒性1例、肾毒性1例、生殖系统毒性2例、其他(脱发、头晕、肺间质病变等)3例。

2.2 基因分型结果 TaqMan荧光PCR结果显示，178例受试者基因型分布：CC基因型71例，CT基因型76例，TT基因型31例。根据Hardy-Weinberg平衡检验方法，对各基因型等位基因频率进行χ2检验，结果提示P>0.05，等位基因分布比较差异无统计学意义，符合遗传平衡定律。

2.3 ADRs的影响因素分析 使用二元Logistic回归分析方法分析患者性别、年龄、用药时间、基因型因素与患者是否发生ADRs的相关性。结果提示患者的基因型与其发生ADRs结果有关；TT基因型与CT基因型比较差异有统计学意义(OR=3.032，95%CI：1.259～7.298，P<0.05)，TT基因型与CC基因型比较差异无统计学意义(OR=1.611，95%CI：0.683～3.801，P>0.05)，CT基因型与CC基因型比较差异无统计学意义(OR=0.531，95%CI：0.265～1.064，P>0.05)；TT基因型较CT基因型患者更易发生ADRs。性别、年龄及用药时间对是否发生ADRs的影响差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.4 基因多态性与ADRs的关系 178例受试者中71例发生ADRs，其中CC基因型31例、CT基因型23例、TT基因型17例。在各个基因型患者中，TT基因型ADRs发生率最高，约54.8%，其次CC基因型(43.7%)，CT基因型最低(30.3%)。三组基因型间ADRs发生率比较差异有统计学意义(χ2=6.248，P<0.05)。进一步分析各基因型患者不同类型ADRs的发生差异。CC基因型中，胃肠道反应15例、血液系统毒性16例、肝毒性2例、肾毒性1例，生殖系统毒性4例，其他1例；CT基因型中，胃肠道反应11例、血液系统毒性12例、肝毒性1例、肾毒性1例、生殖系统毒性1例、其他2例；TT基因型中，胃肠道反应5例、血液系统毒性7例、肝毒性4例、肾毒性2例、生殖系统毒性1例、其他3例。三种基因型不同ADRs发生频率比较差异无统计学意义(χ2=10.938，P>0.05)。此外，在监测RA患者血常规指标时，发现患者在应用MTX后，后期较初期平均红细胞体积(MCV)有增高趋势，有35例患者后期出现MCV值高于正常上限，其中CC基因型14例、CT基因型13例、TT基因型8例，基因型间频率比较差异无统计学意义(χ2=1.056，P>0.05)。对各基因型MCV变化值(ΔMCV)进行统计，使用非参数秩和检验分析方法，结果显示三种基因型MCV变化值差异无统计学意义(H=0.365，P>0.05)

3 讨论

RA是一种较常见的致残性关节炎,未正确治疗的RA可导致关节畸形和功能丧失。早期、合理地选择药物治疗，可控制RA患者的病情进展，改善患者的预后及生活质量。MTX为治疗RA的常用药物之一，多作为RA的起始治疗药物，对控制患者疾病进展疗效显著。此外，对合并关节外表现的RA患者，特别是血管炎，也可推荐使用MTX。MTX的作用机制包括MTX膜转运途径及细胞内途径，其中细胞内途径又包括多聚谷氨酸途径、叶酸途径、蛋氨酸途径、腺苷途径和嘌呤、嘧啶从头合成途径[5]。

细胞内叶酸代谢处于嘧啶、嘌呤从头合成途径和蛋氨酸合成途径的分支上，且10-甲基四氢叶酸(10-MTHF)为嘌呤合成提供碳基，5,10-MTHF为胸腺嘧啶合成提供碳基，5-MTHF为蛋氨酸合成提供甲基[10]。由此可见，叶酸代谢在MTX细胞内途径通路中作用显著。MTHFR作为叶酸代谢的关键酶，其功能活性影响血浆中四氢叶酸水平。由此可推测，MTHFR酶活性与MTX作用可能相关。

多种转化酶参与MTX的作用途径，如二氢叶酸还原酶(DHFR)、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、蛋氨酸合酶(MTR)、胸苷酸合酶(TYMS)、氨基咪唑羧酰胺核糖核苷酸转化酶(ATIC)等[5]。研究发现，MTX及其细胞内稳定形态—甲氨蝶呤聚谷氨酸(MTXPG)，对DHFR、MTR、TYMS、ATIC有直接抑制作用[11-12]，使细胞内多种途径受到影响，从而抑制核酸的合成、影响氨基酸代谢，致使各种免疫细胞的增殖、分化受抑，从而发挥免疫抑制作用。目前虽无研究发现MTX对MTHFR酶活性有直接抑制作用，但有研究观察到MTHFR基因多态性与MTX治疗结果相关[13-15]。

虽然有关基因多态性与MTX疗效的研究有很多，但因地域、纳入条件、样本大小等各方面差异，这些研究结果参差不齐[7-8,15]。因MTX作用机制与叶酸代谢的密切关系，MTHFRC677T基因位点多态性成为研究热点。且部分学者针对MTX治疗结果与MTHFR基因多态性关系的研究进行Meta分析，结果发现，MTHFR C677T基因多态性与MTX毒性有关，MTHFR A1298C基因多态性与MTX疗效有关[9,13-14]。

本研究发现，178例受试者中71例在应用MTX期间出现ADRs，其中胃肠道反应31例、血液系统毒性35例、肝毒性7例、肾毒性4例、生殖系统毒性6例、其他7例。TT基因型患者MTX的ADRs发生率最高(54.8%)，CC基因型其次(43.7%)，CT基因型最低(30.3%)；三种基因型ADRs的发生率比较差异有统计学意义。但在各个基因型间，MTX不同类型ADRs的发生频率比较差异无统计学意义。

在TT基因型个体中，因MTHFR基因677位点C>T突变使丙氨酸被缬氨酸取代，导致MTHFR酶活性降低，从而影响叶酸循环代谢，进而影响MTX相关作用途径，这可能是TT基因型患者更易出现MTX毒性的原因。

在MTX应用期间，随访监测患者血常规指标时发现，后期MCV较初期有明显增高趋势，但这种改变在各基因型的表现差异无统计学意义，这与MTX的抗叶酸合成代谢有关，MTX使DNA、蛋白质的合成受阻，影响细胞核的增殖。

因本研究纳入患者多为MTX与其他DMARDs联用，不易评估MTX的疗效，所以本研究仅探讨了基因多态性与MTX相关ADRs的关系，但未分析药物疗效与其相关性。此外，MTX治疗结果与基因多态性关系研究可能受到MTX与其他DMARDs联用的影响，进一步研究应优化实验方案，尽可能选择单用MTX控制病情的受试者，尽全面地检测MTX途径相关基因多态性，从而明确基因多态性与MTX治疗结果的关系。结合患者的药物相关基因分型结果，有助于风湿科临床医师制定患者的合理有效治疗方案，为RA患者提供个体化治疗。