邹锐涛， 蔡桂月， 谢嘉豪， 陈嵘祎

(1.南方医科大学皮肤病医院，广东 广州 510091；2.广东医科大学，广东 湛江 523024)

黑色素瘤又称恶性黑色素瘤(malignant melanoma)，是由异常黑色素细胞过度增生引起的高度恶性肿瘤，早期即可发生转移,晚期患者预后极差，是极具侵袭性和致命的皮肤癌。现阶段，手术、化疗、放疗等为黑色素瘤主要的常规治疗，而患者对于常规治疗的反应及预后均比较差。近几年免疫治疗在黑色素瘤中的应用已经取得重大发展。美国FDA批准的免疫治疗药物 Pembrolizumab(PD-1抗体)/CTLA-4抗体等用于治疗黑色素瘤能明显延长欧美晚期黑色素瘤患者的生存时间，上述成果获得2018年诺贝尔生物医学奖，但目前PD-1抗体单药治疗黑色素瘤的阳性响应率约为30%～40%，仍有很大一部分黑色素瘤患者对PD-1抗体治疗疗效欠佳[1]。

T细胞是肿瘤免疫中重要的淋巴细胞，不仅能在人体中起免疫监视作用，还能纠正机体的肿瘤免疫功能低下状态，直接杀伤肿瘤细胞，在肿瘤免疫过程中起主导作用[2]。组织驻留记忆T细胞(tissue-resident memory T cells, TRM)在病原体被消灭后仍能存活很长时间，并且在再次感染同一抗原时能迅速作出反应[3]。记忆CD8+T细胞属于TRM，是机体获得长期免疫的一个重要组成部分，在肿瘤免疫中发挥着重要的作用。CD4+T细胞是机体免疫系统中重要的免疫细胞，在肿瘤免疫发生过程中，不同的CD4+T细胞其功能不同，调节性T细胞表现出免疫抑制功能增强，而辅助性T细胞功能减弱[2]。本文对CD8+、CD4+T细胞抑制黑色素瘤相关机制作一简要综述。

1 CD8+T细胞在黑色素瘤免疫治疗中的作用

记忆CD8+T细胞是机体获得长期免疫的一个重要组成部分。最初人们认为记忆CD8+T细胞是循环性的，仅在需要时才进入组织以清除感染。近几年研究发现，记忆CD8+T细胞并不是循环性的，而是永久地驻留在皮肤、肠、肺、脑和女性生殖道等组织中，对感染的病原体提供快速的保护性免疫[4-5]，当记忆CD8+T细胞再次遭受抗原刺激时，能够迅速出现特异性的克隆增殖并且发挥强有力的抗原清除能力[6]。有研究发现前体记忆CD8+T细胞也同样存在于效应细胞中，但并不表现为记忆细胞的功能，因此当病毒或细菌感染后，特异性抗原和记忆CD8+T细胞将会遍布全身，从而达到快速反应以及长期免疫的功能。黑色素细胞分布于皮肤表皮基底层，为记忆CD8+T细胞在异常黑色素细胞恶变时迅速产生反应提供可能。且研究发现，维持CD8+T细胞对黑色素瘤的免疫力需要通过破坏黑素细胞来作为抗原源[3]。

1.1 CD69+CD103+CD8+TRM细胞的抗黑色素瘤作用

TRM细胞是一种永久驻留在皮肤、肠、肺、脑和女性生殖道等组织的记忆T细胞，主要为机体提供快速保护性免疫，以抵御再次感染的病原体。肿瘤浸润的CD8+T细胞呈现常驻表型(CD69+CD103+和/或CD103+)与各种人类癌症预后相关[7-9]。有研究发现，驻留在肿瘤微环境中的CD103+CD8+TRM细胞与免疫治疗Ⅲ期黑色素瘤患者中的生存率增加密切相关，高CD103+CD8+TRM细胞计数的患者5年生存率为50%，而低CD103+CD8+TRM细胞计数的患者5年生存率为20%[10]。CD103+CD8+TRM细胞对黑色素瘤再侵袭也具有重要的保护作用[11]。Park等[12]发现，使用可移植的皮肤黑色素瘤小鼠模型在表皮接种后很长一段时间，小鼠(约40%)仍然没有肉眼可见的瘤体，并且发现肿瘤特异性表皮CD69+CD103+CD8+TRM细胞的产生与这一自发性疾病控制相关。Edwards等[13]通过对未经免疫治疗的黑色素瘤患者的肿瘤标本和接受过程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1, PD-1)治疗的患者的纵向活检标本进行了多参数流式细胞术和定量多重免疫荧光染色，发现在未接受免疫治疗的黑色素瘤患者中，增加的CD69+CD103+CD8+TRM细胞数量与改善的黑色素瘤特异性生存有关，且局部白细胞介素(IL-15)表达水平与这些肿瘤驻留T细胞数量密切相关，高IL-15表达水平的患者预后较好，在IL-15作用下CD69+CD103+CD8+TRM细胞可释放IFN-γ、TNF-α、颗粒酶、穿孔素等细胞毒性因子，有利于杀死黑色素瘤。上述研究表明，检测CD69+CD103+CD8+TRM细胞数量可作为黑色素瘤患者预后的一个相关指标；提示通过体外扩增CD69+CD103+CD8+TRM细胞后回输到患者体内可能可以杀灭黑色素瘤，但体外扩增多代CD69+CD103+CD8+TRM细胞同时也可能会降低其抗肿瘤能力，如何保持该细胞杀瘤作用及提高该细胞体内存活率将是抗肿瘤免疫重要的课题方向。

1.2 细胞因子在CD8+抗黑色素瘤中的作用

干扰素(interferon, IFN)是另一种抗黑色素瘤细胞因子，主要通过直接抗增殖作用、增强自然杀伤细胞活性以及上调肿瘤抗原和(或)人类白细胞抗原Ⅰ类和Ⅱ类产生免疫介导作用来实现抗肿瘤免疫作用; 此外，干扰素还能通过抑制致癌基因来诱导肿瘤抑癌基因表达，同时也具有抗血管生成的作用[19-20]。其中，IFN-γ属淋巴细胞型，是抗肿瘤免疫中最重要的细胞因子，具有抑制细胞生长、促凋亡和激发免疫的作用，在识别和消除转化细胞中起着核心作用[21]。研究发现，CD8+T细胞释放的IFN-γ可下调SLC3A2和SLC7A11(谷氨酸-胱氨酸反转运蛋白系统xc-的两个亚基)的表达，从而损害肿瘤细胞对胱氨酸的摄取，促进肿瘤细胞脂质的分泌，因此起到抗肿瘤的作用[22]。然而Chen等[23]研究发现，在IFN-γ刺激下，转移性黑素瘤释放出的细胞外囊泡上程序性死亡配体(programmed death-ligand 1, PD-L1)增加，从而抑制CD8+T细胞的功能并促进肿瘤生长。研究表明，IFN-γ抗肿瘤作用的同时也会导致机体免疫功能障碍，这点限制了IFN-γ的临床应用[24]。上述研究表明细胞因子网络调控非常复杂，肿瘤微环境细胞因子与肿瘤细胞的相互作用需要更深入的研究。

2 CD4+T细胞在黑色素瘤免疫治疗中的作用

CD4+T细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞。众所周知，突变产生的肿瘤特异性新抗原被认为对肿瘤免疫治疗的疗效有着重要意义，并且越来越多的证据表明，新抗原可能普遍被肿瘤内CD8+T细胞识别，但尚不清楚新抗原特异性CD4+T细胞是否也经常存在于人类肿瘤内。研究发现，即使没有CD8+T细胞，CD4+T细胞也有助于清除肿瘤[25]。Haabeth等[25]发现CD4+T细胞可以间接消除缺乏组织相容性复合体Ⅱ类(MHC Ⅱ)表达的肿瘤细胞。2014年，该团队研究T细胞受体(T cell receptor，TCR)转基因模型，在该模型中可以追踪定义明确的幼稚CD4+T细胞的抗肿瘤反应。他们在骨髓瘤模型(MOPC315)中对MHCIIPOS和MHCIINEG两种肿瘤进行研究，发现两者似乎都需要通过宿主抗原呈递细胞(antigen presenting cells，APC)呈递肿瘤特异性抗原来启动CD4+T细胞。在抗原识别后，幼稚CD4+T细胞分化为Th1细胞并迁移至肿瘤。在肿瘤部位，他们发现在TCR转基因B16黑色素瘤模型中，MHCIIPOS黑色素瘤细胞以穿孔素/粒酶B依赖性方式直接被细胞毒性CD4+T细胞杀死。相比之下，MHCIINEG骨髓瘤细胞被IFN-g刺激的M1样巨噬细胞杀死。2018年，Haabeth等[26]研究是否仅MHC Ⅱ限制性抗原呈递在肿瘤细胞上才能被排斥，发现基因切除MHC Ⅱ的肿瘤细胞在B淋巴瘤和B16黑色素瘤的情况下，并不排除体内肿瘤抗原特异性CD4+T细胞对肿瘤的排斥，表明在肿瘤上表达CD4+T细胞介导的排斥反应不需要细胞本身的MHC Ⅱ类，而且在宿主APC上的间接展示足以有效消除肿瘤。这些结果支持了CD4+T细胞识别分泌的肿瘤新抗原可在肿瘤细胞固有的MHC Ⅱ表达缺失的情况下消除肿瘤，并且突出了肿瘤浸润性APC间接抗原识别的潜在临床意义。

调节性T细胞(regulatory cells，Tregs) 是CD4+T淋巴细胞的一个亚群，控制着机体自身免疫反应。Tregs自身具有免疫抑制性和免疫无能性两种特性，其免疫抑制能力通过抑制T细胞的增殖、分化，阻碍抗原提呈细胞的抗原呈递作用和直接介导靶细胞死亡等方式来实现，并且IL-2已被证明通过优先扩增Tregs来抑制免疫病理，而免疫无能性则表现为对IL-2以及共刺激分子的反应低下[27-28]。有研究表明，大量Tregs存在于肿瘤间质当中，其高密度浸润是临床预后不良的一个标志，Tregs的存在能够有效地削弱自身抗原引起的抗肿瘤免疫，协助肿瘤细胞逃避免疫侦查和杀伤[29-30]。研究发现，大部分的Tregs是由迁移至肿瘤局部的幼稚CD4+T细胞转化而来的[31]。因此，如何阻止幼稚CD4+T细胞往Tregs转化可能是黑色素瘤免疫治疗新的思路。

3 CD8+与CD4+T细胞的共同作用

肿瘤反应性CD4+T细胞的辅助功能提高了肿瘤反应性CD8+T细胞的疗效[32-33]。研究发现，CD4+T淋巴细胞在人体中可以发挥直接抗肿瘤作用，与CD8+T淋巴细胞具有协同作用，能够同时激活CD8+T淋巴细胞，以确保建立并维持细胞毒性作用[34]。而CD8+T淋巴细胞本身是一种抑制/杀伤细胞，通过抑制T淋巴细胞增殖以及抗体合成过程，促进肿瘤持续增殖，这两者之间存在着平衡关系；而且CD4+T细胞与CD8+T细胞在细胞水平上协同调节机体的免疫状态,CD4+/CD8+比值上升提示免疫力增强，反之则下降。而黑色素瘤患者本身处于免疫抑制状态，即细胞免疫功能低下，因此CD4+/CD8+比值对于患者预后相当重要[34]。这均提示CD4+/CD8+比值可作为黑色素瘤患者预后的一个相关指标。且有研究发现，PD-1与PD-L1结合，作为T细胞共抑制分子抑制T细胞活化，结果提示PD-1/PD-L1的抑制明显增强了CD4+和CD8+T淋巴细胞的扩增、细胞因子的分泌和细胞毒活性，从而增强了抗肿瘤反应[35]。

4 结语

黑色素瘤的常规治疗方法欠佳，预后较差。近几年对CD8+、CD4+T细胞抑制黑色素瘤的相关机制有了更深的了解，但也存在一系列问题，如：体外扩增多代CD69+CD103+CD8+TRM细胞会降低其抗肿瘤能力；高剂量的IL-2具有明显的抗肿瘤作用，但也有严重的副作用，况且靶向治疗的进展和T细胞检查点抑制剂的出现，进一步限制其临床应用；IFN-γ具有抗肿瘤作用的同时会导致机体免疫功能障碍；肿瘤抗原容易发生变异，大大提高了黑色素瘤疫苗研制的难度；IL-15可促进CD69+CD103+CD8+TRM杀伤黑素瘤，但易引发该细胞误杀黑素细胞而引起白癜风等。如何将CD8+、CD4+T细胞应用于临床治疗黑色素瘤是值得深入研究的课题。