刘中林，韦玉霞，庞晓霞，廖碧云，陈兴鸿，杨凤莲，王俊利

(1. 右江民族医学院附属医院生殖医学中心，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000)

不孕不育已成为育龄夫妇的一个困扰，据统计，约有10%～15%的夫妇受到影响，且男性因素占30%～50%[1]。而畸形精子症是导致男性不育的主要原因之一。近年来国外的一些学者研究发现，极光激酶C(AURKC)基因的多态性可能与男性畸形精子症有关[2-4]。本研究采用SNaPshot基因分型技术，对广西人群AURKC基因rs1008073和rs2302060位点进行分析，探讨其与畸形精子症的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2018年6月—2019年4月在右江民族医学院附属医院男科就诊的286例男性患者为研究对象，所有研究对象户籍均为广西，且近5年内常住广西。分为畸形精子症组(142例)和对照组(144例)。畸形精子症组纳入标准为：①患者正常形态精子百分率<4%，精液质量分析正常；②夫妻双方共同生活超过1年，且性生活正常，在未避孕措施的情况下无法孕育。畸形精子症组排除标准为：①排除有生殖器感染、损伤、精索静脉曲张等影响精子形态的疾病[5]；②排除有吸毒、桑拿、嗜烟、酗酒、长期接触铝/辐射/油漆等患者[5-6]。对照组纳入标准为：患者正常形态精子百分率≥4%，且其他精液相关检查正常，有正常生育史、身体健康的生育体检男性。排除标准：排除有不良嗜好和不良生活方式的患者，如酗酒、嗜烟、吸毒、长期熬夜等[5]。本研究经医院伦理委员会批准，已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 精液相关检查 根据 WHO《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)标准[7]，使用西班牙SCA检测精液质量，精子形态学检查采用diff-quik染色方法。

1.2.2 全血标本采集及DNA提取保存 所有研究对象给予静脉穿刺，采集静脉血3 ml，注入EDTA-K2抗凝管。根据全血核酸(DNA)提取试剂盒说明书(亚能生物技术有限公司)提取全基因组DNA(离心柱法)，保存于-20℃，备用。

1.2.3 多重单碱基延伸PCR 基因分型由上海天昊生物科技有限公司进行分型，包括PCR引物合成、多重PCR反应、PCR产物纯化、延伸产物纯化、延伸产物测序。其中PCR反应循环程序为：第一步，95℃ 2 min；第二步，94℃ 20 s，65℃ 40 s，72℃延伸60 s，循环11次；第三步，94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃延伸60 s，循环24次；第四步，72 ℃再延伸2 min。PCR引物、延伸引物设计见表1、表2。

表1 rs1008073和rs2302060位点PCR引物

表2 rs1008073和rs2302060位点PCR延伸引物

1.3 统计学方法 统计软件使用SPSS 22.0软件，不符合正态分布的两组计量资料间的比较使用非参数秩和检验，用M(Q25～Q75)表示。AURKC基因突变对畸形精子症的相对风险度使用非条件Logistic统计分析。哈迪-温伯格定律检验基因位点遗传平衡。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的一般临床资料 两组间的精液质量参数、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，而正常形态精子百分率比较差异有统计学意义(P<0.001)，见表3。

2.2 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位点基因分型结果 AURKC基因 rs1008073、rs2302060位点的 PCR 扩增产物片段大小分别为150bp、114bp。ABI3730XL电泳仪检测AURKC基因SNPs分型结果显示rs1008073位点存在CC、CG、GG基因型和C、G等位基因。rs2302060位点存在TT、TC、CC基因型和T、C等位基因。基因测序可以证实我们的SNP基因分型结果，见图1、图2。

表3 研究对象一般资料比较

注：①代表CC；②代表CG；③代表GG。图1 rs1008073基因型

注：①代表TT；②代表TC；③代表CC。图2 rs2302060基因型

2.3 AURKC基因rs1008073、rs2302060位点与畸形精子症的关联性 畸形精子症组和对照组之间AURKC基因rs1008073、rs2302060位点的基因型和等位基因频率分布如表4所示。畸形精子症组基因型分布符合哈迪-温伯格定律(rs1008073：χ2=1.103，P=0.294；rs2302060：χ2=1.837，P=0.175)。对照组基因型分布符合哈迪-温伯格定律(rs1008073：χ2=0.063，P=0.803；rs2302060：χ2=3.330，P=0.995)。两组两个位点基因型经哈迪温伯格平衡定律检验，P均>0.05，提示这两组研究对象群体基因遗传平衡，具有群体代表性。经非条件Logistic回归分析，rs1008073和rs2302060位点的基因型和等位基因频率在两组间差异都无统计学意义(P>0.05)，见表4。

2.4 AURKC基因rs1008073、rs2302060位点单倍型分析 使用在线软件SHEsis对rs1008073、rs2302060位点进行连锁不平衡(LD)分析。结果显示，rs1008073和rs2302060位点D′=0.992，r2=0.984，说明这2个SNP之间存在强连锁不平衡，如图3所示。根据SHEsis软件结果，AURKC基因rs1008073、rs2302060位点存在CT、GC、CC和GT共4种单倍型，但两组间这4种单倍型的频率分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。

表4 两组AURKC基因rs1008073、rs2302060 位点的基因型和等位基因频率比较

图3 AURKC基因rs1008073、rs2302060 位点连锁不平衡分析

3 讨论

精子的发生是一个极其精密而有序的过程，受到许多因素的影响，如内分泌激素和基因，其中任何环节出现问题都会改变精子的生理结构，导致精子形态的异常，影响生育能力，其中基因异常导致精子发生异常最为多见[8-10]。大头多尾精子症是畸形精子症中的一种[11]，与其相关的主要基因是极光激酶C(AURKC)基因[12]。极光激酶A、B和C蛋白是细胞周期调节酶，确保在细胞分裂过程中纺锤体装置的准确形成。在精子发生过程中，AURKC蛋白保证了染色体在减数分裂和胞质分裂过程中的准确分离[13]。

表5 单倍型在畸形精子症组和对照组中的分布

AURKC基因位于人染色体19q13，有7个外显子，在人体内编码309个氨基酸蛋白，到目前为止，已报道的SNP主要有6个：c.144delC、c.686G>A、c.744C>G、c.930+38G>A、c.436-2A>G及c.269G>a[14]。其中AURKC.144delC是最常见的大头精子症的遗传原因，约1/10000男性会有，这一频率对于导致生殖缺陷的突变来说非常高[15]。因此，在6个SNP里，c.144delC的研究也最多，Dieterich K等[2]对来自北非的10名不育男性进行了全基因组微扫描，在Aurora C的编码区发现了c.144delC突变，这些男性的精子几乎是100%的四倍体。Kerch FE等[3]在西非地区对18例畸形精子症患者研究时，在试验组AURKC基因中检测出了纯合c.144delC突变。Khelifa MB等[4]在研究欧洲和非洲87例典型大头多尾精子症患者时发现，试验组中有85%的患者带有c.144delC突变。研究表明[16]，c.144delC突变造成一个移码，导致氨基酸49处的亮氨酸到色氨酸密码子的变化，而移码后的22个错义残基是翻译终止密码子，导致蛋白质截短，这种改变使AURKC的催化结构域始于42位，导致激酶结构域几乎完全丢失，从而降低染色体乘客复合体(CPC)对染色体的定位能力，使精原细胞不能完成减数分裂I，当减数分裂失败时，而精子发生又未受影响，就会导致四倍体多个鞭毛精子的形成。目前，国内有1例该问题的研究报道：穆雪梅等[17]在四川地区研究AURKC基因c.144delC位点与男性不育的相关性时，未能在AURKC基因中检出 c.144delC突变。这可能是基因多态性具有地域、种族差异导致的结果，也有可能是由于样本量少、实验条件有限、各种风险因素资料缺乏等关系引起。本次研究的rs1008073和rs2302060位点也与畸形精子症的发病风险无相关性，因此这2个位点不能作为畸形精子症发病风险的分子遗传标记。

综上所述，AURKC基因多态性与男性畸形精子症的研究在国外男性群体发现不同研究结论，但在我国仅有少数研究，且多为单一国外人群阳性位点的验证。本次研究的2个位点与畸形精子症无相关性，所以下一步我们需要寻找更多、更适合的位点进行深入研究，提高实验条件，收集更多的样本，提高结论的可靠性。