廖丽娟，黄已桃，戴园园，李如佳，覃春，李晓华，吴标良，黄衍强，黄永毅

(右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心，广西 百色 533000)

山黄皮，又称鸡皮果、野黄皮、假黄皮，是芸香科植物，属于亚热带珍稀野生植物，是一种具有特殊香味的水果，主要分布在桂西南石山地区，以广西龙州县分布最多[1]。山黄皮果实富含多种氨基酸和矿物质，具有祛湿、消炎、消暑、化滞、健脾健胃的功效，可鲜食、调味、入药，具有很大的药用价值，我国民间常用于治疗上感、疟疾、高血糖、腹痛及胃炎等症状，其粗提物药理活性广泛[2]，但其不同部位、不同的提取方法，其降糖效果可能不同，抗菌作用的抗菌谱也会有很大的差异。近年来，从植物中筛选、分离和纯化生物活性成分是研发新药的有效途径[3]。本文旨在研究山黄皮果皮和果核水提物的抗菌作用和降血糖作用，以期明确山黄皮水提物最佳药效部位，为后续研发山黄皮药用价值提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 在广西龙州县采集新鲜的山黄皮果皮与果核(Clausena indica)，并经过右江民族医学院生药学刘春荣老师鉴定为芸香科植物黄皮树的果实。

1.1.2 仪器 电子天平、捣药罐、铝锅、冰箱、真空干燥机、灭菌锅、干燥箱、离心机、恒温培养箱、紫外分光光度计、超净工作台、滤菌器、灌胃针、注射器、血糖仪、血糖试纸等。

1.1.3 试验菌种 枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌(敏感)、霍氏肠杆菌、摩氏摩根菌、白色念球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(敏感)、溶血葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌。所有菌种均由右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心提供。

1.1.4 试剂 MH培养基、LB培养基、肉汤液体培养基、柠檬酸、柠檬酸三钠、链脲佐菌素(Streptozocin，STZ) 、二甲双胍、生理盐水、酒精等。

1.1.5 动物 SPF级C57BL/6小鼠，雄性，4～5周龄，30只，体重17～22 g。购于长沙天勤生物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014。

1.2 方法

1.2.1 山黄皮抑菌试验

1.2.1.1 山黄皮果皮、果核活性成分物质提取制备 参考徐绍成等[4]方法，山黄皮去梗、去果肉，分离果皮与果核，用铜冲分别捣碎果皮、果核，准确称量得果皮104 g，果核201 g。山黄皮果皮取104 g，加水没过果皮浸泡30 min，煎煮3次，第1次、第2次煮1 h，第3次煮30 min，其间需加水补充蒸发的水分，使用玻璃棒搅动，避免糊底，每次煎煮完成后，过滤，得滤液，再加适量水重新煎煮。合并3次滤液，浓缩，真空干燥，干燥完成后放置-20℃冰箱保存备用。果核的提取方法同上。

1.2.1.2 含药培养基的制备 根据培养基配制说明书，配制MH培养基、LB培养基、肉汤液体培养基，置于灭菌锅中灭菌。固体培养基灭菌完成后置于干燥箱中，待冷却至60℃取出培养基，准确称量山黄皮果皮、果核提取物的重量，将药物加入已灭菌固体培养基中，设置100 mg/ml、10 mg/ml、1 mg/ml、0.1 mg/ml 4个浓度的含药培养基，待药物完全溶解后，倾注平板，含药培养基制备完成。为确认培养基是否污染，将制成的培养基随机抽取1个置于37℃培养箱培养24 h，作无菌试验，观察结果。

1.2.1.3 菌悬液的制备 采用麦氏比浊法测量各受试菌株的浓度，受试菌株经复苏活化、培养后，用肉汤液体培养基制备成浓度相当于0.3麦氏标准比浊管的菌悬液，菌液浓度相当于1×108CFU/ ml，再稀释为1×106CFU/ ml，其中白色念球菌需制备成浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，菌液浓度相当于0.5×106CFU/ ml，再稀释为0.5×103CFU/ ml，菌悬液制备完成。

1.2.1.4 抑菌实验方法 在含药培养基背面划分区域，并注明受试菌名，用微量移液器取各受试菌菌悬液1 μl，接种到相应的区域内，滴3次，形成直径为3～5 mm的菌斑。其他细菌菌液同上，同时将相应剂量的液体培养基接种于含药培养基中作为阴性对照，置于37℃恒温培养箱中孵育24～48 h，将培养基置于暗色、不反光的物体表面上观察实验结果，判断实验终点，MIC为抑制细菌生长的最低药物浓度。实验重复3次，取平均结果。

1.2.2 山黄皮降血糖试验

1.2.2.1 药材与药物成分提取浓度的制备试验 选用山黄皮果皮为药物提取原料，提取方法同上。将提取物溶于无菌的UP水中，分别配制成200 mg/ml和50 mg/ml 2个药物浓度，于4℃冰箱保存备用。

1.2.2.2 STZ溶液的配制 准确称量2.10 g 柠檬酸和2.94 g柠檬酸三钠分别加入100 ml双蒸水中配成柠檬酸母液的A液和B液；将A、B液按1∶1.32比例混合，测量pH值，调定溶液pH=4.0，即配制好的0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液。将STZ溶于柠檬酸钠缓冲液中，制备浓度为12 mg/ml的STZ溶液，并用0.22 μm滤菌器过滤除菌。配制过程中需严格避光，现用现配。

1.2.2.3 建造糖尿病模型组 参考其他学者研究方法[5-6]，造模前12 h 禁食，模型组小鼠腹腔注射STZ，对照组小鼠注射等量柠檬酸钠缓冲液。STZ注射0.15 ml/10 g小鼠，给药1次/天，连续2 d后，测定空腹血糖，选择空腹血糖高于11.1 mmol/L的小鼠纳入正式实验。

1.2.2.4 动物分组及给药 实验动物分正常对照组、病理模型组、阳性药组、受试药山黄皮200 mg/ml和50 mg/ml两个剂量组。正常对照组6只，灌胃生理盐水；挑选糖尿病模型组24只，分4组，平均每组6只，即病理模型组，灌胃生理盐水；阳性药组，灌胃二甲双胍；受试药山黄皮200 mg/ml和50 mg/ml两个剂量组，分别灌胃不同浓度的山黄皮成分提取物；灌胃给药体积为每只0.4 ml，连续给药15 d。每日进行药物治疗，除了测血糖当天禁食不禁水8 h之外，其余时间正常供给食物和水，每隔3 d称重和剪尾采血用血糖仪检测1次空腹血糖值，并记录小鼠体重和血糖的变化。每次灌胃前，待药物恢复至室温、摇匀，使用干净的灌胃针灌胃，同时给药治疗过程中观察记录小鼠的状态并及时清理鼠笼，保持实验小鼠的良好居住环境。

2 结果

2.1 山黄皮抑菌结果 培养24～48 h后，对照阴性对照无菌落生长，可证明试验结果有效。本试验中不同浓度的山黄皮果皮和果核均有一定的抑菌效果，其中在试验范围内山黄皮果皮对各受试菌的最低抑菌浓度(MIC)均为100 mg/ml。而山黄皮果核对各受试菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为：枯草芽孢杆菌、鲍曼不动杆菌(敏感)、霍氏肠杆菌、摩氏摩根菌、白色念球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(敏感)、溶血葡萄球菌和铜绿假单胞菌均为100 mg/ml；肺炎克雷伯菌>100 mg/ml，说明山黄皮果皮成分提取物抑菌谱更宽，而山黄皮果核抑菌谱较窄。见表1。

表1 山黄皮果皮和果核对各受试菌的抑菌浓度结果

2.2 山黄皮果皮降血糖试验结果

2.2.1 试验小鼠生长状况 正常对照组小鼠生长状况良好，无任何异常；模型组小鼠毛发稀疏，光泽度低，饮水多，嗜睡，活跃度低，无足溃烂情况，小鼠的粪便较多且有特殊臭味；阳性药组小鼠毛发光泽度较高，山黄皮200 mg/ml剂量组毛发光泽度较模型组有改善，山黄皮50 mg/ml剂量组无明显变化。

2.2.2 试验小鼠体重变化对比 在给药过程中，正常对照组小鼠体重随着给药时间的增加而缓慢升高。与正常对照组对比，第6天、9天、12天、15天病理模型组的小鼠体重下降，差异有统计学意义(P<0.05)。与病理模型组对比，阳性药组小鼠体重升高，山黄皮果皮50 mg/ml剂量组小鼠体重呈上升变化，200 mg/ml剂量组也增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表2及图1。

表2 各组小鼠体重变化 单位：g

图1 各组小鼠体重变化

2.2.3 试验小鼠血糖变化 病理模型组与正常对照组相比，病理模型组血糖水平始终高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。与病理模型组相比，阳性药组血糖水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)；山黄皮果皮50 mg/ml剂量组血糖水平有下降的趋势，200 mg/ml剂量组血糖水平也下降，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3及图2。

图2 各组小鼠血糖值变化

3 讨论

本研究采用传统的水提法提取山黄皮果皮和果核的成分，用于10种常见菌的抑菌试验检测出浓度为100 mg/ml的水提取物抑菌效果最佳。试验结果初步表明，山黄皮果皮和果核水提取物均具有一定的抑菌作用。对比赵丰丽等[7]研究以黄皮叶为提取材料并发现黄皮叶具有明显的抑菌效果，本研究中选用果皮和果核也证明具有抑菌的作用，表明山黄皮具有更大的药用价值和广泛的药理活性；另有研究[7]用乙醇、石油醚和水三种溶剂进行黄皮叶活性成分的提取，结果显示黄皮叶乙醇提取物抑菌效果最佳，水提物无明显效果，而本研究中则证明果皮和果核水提物同样具备一定的抑菌作用。本研究与其他学者[7]的研究对比，本研究的特色在于扩大了抗菌谱检测，发现山黄皮不仅对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(敏感)具有抑菌作用，而且对霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、摩氏摩根菌、溶血葡萄球菌、白色念球菌、鲍曼不动杆菌(敏感)、肺炎克雷伯菌等常见菌也有抑菌作用，而且表明山黄皮果皮水提物具有更宽的抗菌谱，山黄皮果皮部位提取物可能更适合应用在食品的保鲜和防腐等方面。

山黄皮果皮降血糖作用的试验，结果表明注射二甲双胍的阳性药组降血糖效果最显著，对比山黄皮果皮200 mg/ml和50 mg/ml剂量组，山黄皮果皮200 mg/ml剂量组虽然体重有升高趋势、血糖有明显下降的趋势，但是没有统计学意义。对比黄小桃等[8]研究黄皮叶水提物对STZ诱导的糖尿病大鼠的作用及其机制：黄皮叶可降低糖尿病大鼠的空腹血糖和餐后血糖值，修复和促进大鼠胰岛细胞的增殖生长，使得胰岛细胞数量增多，改善胰岛细胞受损的功能，使葡萄糖的利用率提高，降低高血糖状况。本次试验中山黄皮果皮水提物并没有达到显著的降血糖作用，可能的原因：①山黄皮降血糖的主要活性成分并不在果皮中，而在山黄皮叶等其它部位；②设置给药浓度的差异，可能是给药剂量不足，导致小鼠降血糖作用不明显；③给药时间和周期的差异，黄小桃等[8]试验中以每天给药1次，连续5周的给药方式，每周采血观察血糖值变化，本试验中仅连续给药15 d，每3 d采血观察血糖值变化；④本研究用的实验动物是小鼠，而其他学者是用大鼠，两者之间可能也存在一定的差异。

本研究分析了山黄皮果皮和果核水提物的抗菌作用和降糖作用，拓展了山黄皮的抗菌谱，明确了山黄皮果皮部位抗菌效果更佳。本研究并未涉及其山黄皮单体有效成分的提取和活性分析，有研究报道，从黄皮叶中可分离出具备明显降血糖作用的香豆精类等天然化合物[9-10]，后续研究我们将根据前人报道和结合本实验结果，注重从山黄皮果皮和山黄皮叶部位分别提取活性成分，分别探索其抑菌和降血糖作用，以及对活性单体进行改造和修饰，为提高山黄皮抑菌和降血糖药用价值提供参考。