孟国庆，张顺响，黄一鸣，王宜磊

(菏泽学院农业与生物工程学院, 山东 菏泽 274015)

引言

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews)，芍药科植物，有3 000年的种植历史.牡丹不仅作为一种观赏性花卉，同时也是珍贵的中草药材，深受人们喜爱.而山东菏泽是牡丹的主要产出地之一，2019年牡丹种植总规模达到49万亩，被誉为世界上最大的牡丹生产基地[1].另外，由于牡丹籽的高含油量，油用牡丹在菏泽地区被作为木本油料植物[2]种植，种植规模达到了15万余亩.

牡丹作为多年生落叶灌木植物， 根部病害会因为土壤中病原微生物的积累而越来越严重.其中，由茄病镰孢菌(Fusariumsolani)引起的根腐病就是牡丹根部病害的一种，根腐病会造成牡丹植株矮小，叶片发黄，地下根系发黑腐烂，引起牡丹植株的枯萎死亡.每年因根腐病害给牡丹种植业造成巨大经济损失，种植年限的增加是引起牡丹根腐病发病率增高的重要原因之一[3].

目前，对牡丹根腐病防治的主要方法为农药喷抹，但防治效果不佳，而且残留的农药会对自然界的生态平衡造成严重的破坏.在环保和安全成为时代主题的今天，绿色无污染的生物防治方法成为防治各种植物病虫害的首要选择.

据报道，对烟草疫霉[4]、大豆炭腐病[5]等植株病害的生物防治，是从植株病害附近进行病原菌的拮抗菌和根际促生菌[6]的筛选分离后，研发专用菌剂或菌肥，且取得了较好的实用效果.目前应用于植物根腐病的生物防治菌株主要包括三大类：细菌、真菌和放线菌.在关于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)[7]的报道中，研究者发现了解淀粉芽孢杆菌对苦瓜枯萎病(Cucurbitwilt)和稻瘟病(Magnaportheoryzae)等一些植物的真菌病害有不错的防治效果.解淀粉芽孢杆菌可以通过分泌几丁质酶和伊枯草菌素等物质拮抗病原真菌类.此外，有研究报道木霉(Trichodermasp.)[8]对多种植物真菌病害具有较好的生物防治效果，主要是通过竞争与抗生作用、诱导植物增强抗性作用等生防机制，对镰刀菌 (Fusarium-spp.) 、腐霉菌 (Pythiumspp.)等植物病害真菌产生抑制效果.这证明从植株病原菌所处自然环境中筛选拮抗菌的方法有效可行.

本实验通过平板对歭法筛选牡丹根际土壤中稳定、高效拮抗牡丹根腐病原菌的微生物，为生物防治牡丹土传病害菌肥的开发与应用拓展微生物资源.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤

菏泽学院植物园、曹州牡丹园多年生牡丹发病植株根际土壤.

1.1.2 供试根腐病原菌

茄腐镰孢菌(Fusariumsolani)为菏泽学院农业与生物工程学院微生物实验室保藏并提供的.

1.1.3 实验培养基

PDA培养基：马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g，补至1 000 mL，pH自然，于112 ℃湿热灭菌20 min.

LB培养基：NaCl 5.0 g，酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，琼脂20.0 g，补至1 000 mL ，20% 氢氧化钠调pH 至7.2，于121 ℃湿热灭菌20 min.

淀粉培养基[9]：淀粉水解生化实验.

葡萄糖蛋白胨水培养液和糖发酵培养基[9]：生化实验.

1.2 实验方法

1.2.1 采集土壤

在菏泽学院植物园、曹州牡丹园多年生发病牡丹植株根际附近采集土样.拨开土层约6 cm采集发病植株根际土样，每个采样点取样后，标记备用.

1.2.2 土壤稀释及涂布培养

将取回的土样烘干过筛，称取10 g，混匀在已灭菌且装有90 mL蒸馏水的锥形瓶中，充分摇匀30 min，然后在进行梯度稀释.涂布LB培养基平板，于30 ℃恒温箱培养，采用三区划线法对菌落分离纯化.

1.2.3 拮抗菌筛选

对分离出的菌落，采用平板对歭[10]法筛选牡丹根腐病茄病镰孢菌的拮抗菌.

初筛：以茄病镰孢菌作为靶标菌，点种于PDA平板中心，将分离纯化的菌落用牙签分三点接种于距靶标菌周围25 mm位置，28 ℃恒温箱培养2～4 d后观察.点种菌落与靶标菌菌落之间存在抑制带现象或抑制圈，即判定该分离的菌株与牡丹根腐病菌存在生长发育或繁殖等方面的拮抗效应.记录拮抗初筛结果，开展复筛工作.

复筛：重复平板对峙试验，将有拮抗效应的菌落再次点种于PDA培养基中央靶标菌菌落25 mm处，对称两点接种初筛得到的菌株.恒温箱中28 ℃培养，2～4 d，验证和测量其拮抗效果，并进一步做好优良拮抗菌株的筛选和优化.

1.3 形态学和生理生化特征的观察

在完成对拮抗菌的初筛和复筛工作，在超净工作台的环境中完成在LB培养基上划线.30 ℃的恒温箱中培养72 h，对菌落的大小与形态，透明度与颜色等特征记录.分别参阅《常见细菌鉴定手册》[11]和《真菌鉴定手册》[12]对分离到的细菌和真菌进行初步鉴定.

1.4 生理生化实验

参考《微生物学实验手册》[9]，对所筛选的拮抗细菌菌株R9和菌株R15进行革兰氏染色，芽孢染色及生理生化实验.所有理化实验均设置对照组.

1.5 分子生物学实验

1.5.1 拮抗细菌16S rDNA的PCR扩增和测序

PCR扩增过程： 95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s, 72 ℃ 延伸2 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min.实验所用的引物为：P1(5′-AACTGAAGTTTGATCATTCA-3′)和 P2(5′-TACGGTTACCTTGTTACATGCC-3′)扩增的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由南京擎科生物科技有限公司完成测序.

1.5.2 序列测定结果分析

将获得的16S rDNA序列与NCBI数据库序列进行Blast比对分析，并通过软件MEGA 5.1中的Neighbor-Joining法[13]完成系统发育树的构建.

2 结果与分析

2.1 拮抗菌筛选

根据菏泽学院植物园、曹州牡丹园多年生牡丹发病植株根际采集的土样.分离纯化后得32株不同菌落特征的微生物.以实验室现有牡丹根腐病菌茄病镰孢菌为靶标菌，采用平板对歭法，初筛共得到3株对茄病镰孢菌具有拮抗作用的微生物 (见图1)，分别为命名为菌株R1、R9、R15.

图1 菌株的对歭初筛

进一步对初筛获得的3株具有良好拮抗性能的菌株进行复筛，并测量抑菌圈直径，复筛结果见表1.

表1 抑菌圈直径大小测量

2.2 拮抗菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定

将分离到的3株菌株分别点接或三区划线接种到固体培养基进行培养，并观察其菌落形态.菌株R1、R9与R15菌落形态及电镜照片见图2，形态描述见表2.

图2 3株菌的菌落形态观察

表2 3株菌的菌落形态特征

2.2.2 生理生化鉴定

根据菌落特征和《常见细菌鉴定手册》[11]，菌株R9和R15鉴定为细菌，并对菌株R9和R15进行生理生化实验分析，实验结果见表3.

表3 生理生化鉴定

生理生化分析结果显示，菌株R9和R15均为革兰氏阳性菌，有芽孢，葡萄糖产酸试验均为阳性.菌株R15具有解淀粉能力，VP实验结果阳性，吲哚实验阴性，而菌株R9不能水解淀粉，VP实验结果阴性，吲哚实验阳性.

2.2.3 菌株R9和R15的分子生物学鉴定

PCR扩增菌株R9和R15 的16S rDNA和测序，并与NCBI数据库序列进行Blast比对分析.运用MEGA 5.1的Neighbor-Joining算法构建系统发育树.菌株R9系统进化树见图3，菌株R15系统进化树见图4.

图3 菌株R9系统进化树

图4 菌株R15系统进化树

菌株R9的16S rDNA同Bacillussp. BAB 4854和Bacillussp. 6119的相似度分别为99.64%和99.73%，结合菌株R9的菌落特征将其鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.).

R15菌种经16S rDNA序列比对后，同解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensNBRC 15535)和(BacillusamyloliquefaciensMPA 1034)的序列比对度100%.但因为未处于同一分支，所以表明在系统发育进化过程中不同步.和莫海威芽孢杆菌(Bacillusmojavensis)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的16S rDNA序列相似度同样为100%，但菌株R15和贝莱斯芽孢杆菌(BacillusvelezensisstrainFZB42)、(Bacillusvelezensis-strainCBMB205)同属一系统进化分支，据此系统进化分析，初步鉴定菌株R15为芽孢杆菌属贝莱斯芽孢杆菌.

根据菌株R1菌落形态和细胞形态，参照《真菌鉴定手册》初步将其鉴定为木霉属真菌，后续借助18S rDNA序列对其进行分子生物学鉴定，明确其具体种类.

3 讨论

本实验从菏泽学院植物园和曹州牡丹园多年生牡丹根际取样，以茄病镰孢菌为靶标菌，采用平板对峙实验，进行拮抗菌株筛选.得到对牡丹根腐病菌具有拮抗性能的真菌1株、细菌2株，命名分别为菌株R1、R9和R15.根据形态学特征、生理生化反应和系统树构建，分别将菌株R9和R15鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.).根据菌株R1菌落形态和细胞形态，初步将其鉴定为木霉属真菌.

实验筛选的菌株R15为芽孢杆菌属的贝莱斯芽孢杆菌，据报道能够定殖于根际成熟区，产生的非挥发性物质对植株根部生长有促进作用，是植物根际促生菌[14].木霉属真菌的生防机制是通过与植物建立类似菌根真菌的关系，刺激植物生长，并诱导植物产生拮抗活性物质[15].

利用合理的技术将生物防治菌有效地运用到防治植株的病害, 同时对环境不造成污染，是生物菌肥在植株病害防治方面的优点，而且生物菌肥对人畜无害.目前生物菌肥在蔬菜和部分花卉种植业中得到应用，但在牡丹植株病害防治方面却少有研究资料.这表明我们不仅应该研究牡丹植株病害生防菌，而且要开发生物菌肥的生产工艺，让具有生防功能的生物菌肥早日运用到牡丹的栽培种植中.

实验研究筛选到的3株拮抗菌为牡丹根腐病的生物防治提供了新的微生物资源.下一步拟研发成生物菌肥，应用到牡丹根腐病害的防治，不仅解决牡丹植株病害方面的问题，也要解决牡丹种植区土壤经过连续多年种植造成的土壤板结问题，土壤有害微生物菌落富集和土壤有益菌数量减少的问题.相信随着生物菌肥技术的发展，牡丹根部病害的问题会得到有效解决.