李 佳,赵又谊,赵秋影,莫辉明,岳屹立

(1.延安大学医学院病理生理学教研室，陕西 延安 716000；2.空军军医大学神经生物学教研室，陕西 西安 710032；3.延安大学医学院生理学教研室，陕西 延安 716000)

中枢神经系统疾病是由于各种因素导致脑与脊髓结构或功能损伤，从而引起的一系列疾病，因神经元损伤的不可逆性，探究其损伤机制也是当下研究热点。一般认为细胞死亡方式有凋亡坏死两种，然而近来发现了一种新的细胞死亡方式，是由信号通路介导的细胞死亡，兼具坏死和凋亡的特点，故称之为程序性坏死。

1 程序性细胞坏死(Programmed cell necrosis，PCN)及其机制

1.1 程序性细胞坏死 细胞死亡方式主要分坏死和凋亡两种。一般认为坏死是细胞受到病理刺激后，不受控制的死亡方式，质膜破坏、细胞器肿胀、细胞内容物渗漏是其典型的形态学特征。但凋亡则是为维持内环境稳定，受基因严格调控、自主有序的死亡方式，与细胞坏死的被动性相比，凋亡是主动的过程，受到严格的基因激活、表达及调控，在细胞发育、维持稳态及发病机制中起到重要作用，其显著特征包括核固缩、裂碎、分解，膜泡化形成凋亡小体。然而最近研究发现还存在一种活跃的、有多种因子参与的、受到严格调控的细胞坏死，称之为PCN[1]。这种坏死方式的胞浆和胞膜具有典型的坏死样形态，研究发现诱导程序性细胞坏死的过程涉及到很多细胞因子 [如肿瘤坏死因子(TNF)、Fas配体、TNF-α凋亡因子、双链RNA、γ干扰素等]的参与。与细胞凋亡时激活Caspase-3相比，程序性坏死的发生不依赖于Caspase-3的激活，具有其独特特征[2]。

程序性细胞坏死会引发很多病理过程，如心、肾、脑缺血再灌注损伤[3]，以及病原体性或损伤性炎症疾病等[4]。因此，该坏死通路很可能成为预防细胞死亡的潜在靶点。在大鼠[5]、豚鼠[6]离体心脏缺血再灌注模型中用necrostatin-1或necrostatin-5等程序性坏死抑制剂干预后，发现均起到了心脏保护的作用。在很多中枢神经系统疾病中，程序性细胞坏死也起到了至关重要的作用。Degterev等[7]报道称程序性坏死介导24(S)-hydroxycholesterol诱发的神经元死亡。动物实验中necrostatin-1可延迟小鼠脑缺血性损伤[8]。小鼠模型内注射necrostatin-1，对脑出血(ICH)继发的神经血管损伤也具有保护作用[9]。上述研究表明程序性坏死在防治中枢神经系统疾病中很有可能起到重要作用，因此了解其信号机制具有重要临床意义。

1.2 程序性细胞坏死的介导 程序性坏死是坏死的一种，启动由其死亡受体及其配基实现、随后通过死亡受体完成介导。Fas、TNF-receptor 1(TNFR1)、TNFR2、TRAIL receptor 1(TRAILR1) 以及TRAILR2等死亡受体不仅是凋亡信号的起始，也在激活程序性坏死中发挥重要作用。

TNF-α是最为重要的程序性坏死诱导物之一。TNF-α可以通过TNFR1胞外部分Cys-rich domain 1区域组装的前配体激活TNFR1。激活后形成的三聚体，可以在其胞内区募集到各种蛋白，如与TNFR相关的死亡结构域(TRADD)，激酶受体相互作用蛋白1(RIP1)，胞内凋亡抑制因子1(cIAP1)，cIAP2，TNFR相关因子2(TRAF2)和TRAF5等，募集后形成复合体Ⅰ，内化后其中的RIP1去泛素化与其他分子结合形成复合体Ⅱ，该复合体构成诱发凋亡或程序性坏死的核心组分。

RIPs是丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，有启动、调控细胞应激的作用，参与调控凋亡、坏死或存活。其中不论是凋亡还是程序性细胞坏死，RIP1均有调节作用。cIAP介导的RIP1泛素化可在死亡复合体形成及活化阶段阻碍RIP1发挥作用，进而减少Caspase-8的激活。用Pan-caspase抑制剂阻断细胞凋亡时， Fas配体和TNF-α等死亡信号可触发程序性坏死通路以作为细胞死亡的替代方式。RIP1激酶变构抑制剂(Necrostatin-1)可以改变RIP1激酶结构，对由死亡受体通路引发的，依赖于Caspase的程序性坏死有特异性阻止作用，所以在程序性坏死信号的启动中RIP1活性也是不可或缺的一部分。除RIP1外，RIP3激酶活性也与非Caspase依赖的死亡模式有关。Christofferson等[10]用基因工程小鼠表达出失活的RIP3激酶后，动物的所有程序性细胞坏死均被阻断。以上发现均提示RIP激酶在程序性细胞坏死中具有调节作用。

RIP1是一个74 kDa的蛋白，氨基端含有一个丝/苏氨酸激酶结构域(KD)，羧基端含有一个死亡结构域(DD)，N端有与RIP相同类型相互作用基序(RHIM)的中间结构域，该结构域可以与RIP3中的RHIM和一个羧基端DD结构区结合。RIP1羟基端结构域可以调节RIP1与Fas以及其他DD-containing蛋白的相互作用。RIP1是死亡诱导信号复合体(DISC)的关键组成部分，对细胞命运的决定起到了重要作用。除RIP1外，其同源激酶RIP3也具有触发程序性坏死的功能。在小鼠巨细胞病毒感染的相关研究中找到了细胞存在RIP3依赖而与RIP1无关的程序性坏死的证据[11]。RIP1可以被Lys63-去泛素化蛋白酶(CYLD)去泛素化然后同TRADD、FAS-相关死亡结构蛋白(FADD)、Caspase-8形成复合体，即DISC。DISC中Caspase-8的活化是Caspase凋亡级联反应发生的源头，基因修饰或药物干预将Caspase-8活性抑制，RIP1-RIP3复合体会激活程序性坏死信号。目前尚不清楚FADD和TRADD是否也是程序性坏死信号复合物或坏死小体(Necrosome)组装所必需的蛋白。

RIP3在坏死的发生中也发挥关键作用。研究显示，RIP3和RIP1通过RHIM而相互作用促进坏死小体装配完成[12]。RIP1(IQIG)或RIP3(VQVG)的核心残基RHIM突变会破坏细胞坏死小体的形成和程序性坏死，RIP激酶活性和坏死细胞重组可能以前馈的方式放大信号。混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)是RIP3依赖性坏死的中介物，RIP3可以在其苏氨酸357和丝氨酸358残基上将MLKL磷酸化，这些磷酸化的发生对坏死有至关重要的作用。敲除MLKL后具有抑制坏死的作用。缺乏MLKL的细胞对TNF-α诱导的坏死有抵抗力，也证明了MLKL在TNFα诱导的坏死中发挥关键作用。在结构上，MLKL拥有激酶结构域，但却并无真正激酶的活性。MLKL伪活性位点的突变导致的坏死本质是与RIPK3无关的，MLKL修饰在RIPK3下游坏死通路也起到重要作用。

同其他E3泛素连接酶一样，Lys63连接的RIP1会在cIAP的催化下使聚泛素基团增加，然后提供三个靶点，转化生长因子β激酶1(TAK1)可在此结合，TAK1结合蛋白2(TAB2)，与TAB3构成TAK1-TAB2-TAB3复合体，激活核转录因子-κB(NF-κB)，同时反式激活如细胞FLICE类抑制蛋白(c-FLIP)等细胞保护基因。若将TAK1敲除则会导致细胞发生程序性坏死倾向。然而，若长时间和过度激活TAK1则会引发RIP3磷酸化和活化，甚至无需TNF刺激也会导致程序性坏死，但TAK1消融则会导致Caspase依赖的凋亡发生。因此，TAK1可能是凋亡和程序性坏死共同的上游调控因子。

1.3 程序性坏死过程 溶酶体膜透化(LMP)是TNF-α诱导程序性坏死的早期步骤[13]。溶酶体蛋白酶释放到在胞浆中可能导致体内重要蛋白消化并激活其他酶类，尤其是Caspases相关蛋白。LMP可被各种不同的刺激物激活，除过ROS物质外，还有清洁功能的亲溶酶体混合物、一些内细胞源性死亡蛋白等。大量LMP可导致细胞发生无Caspase激活性死亡，而且在程序性坏死中也确实发现有LMP的存在[14]。胞质磷脂酶A2(cPLA2)和神经酰胺可以在脂质过氧化的上游刺激LMP。在L929型细胞中使cPLA2过表达则抗TNF的程序性死亡会更敏感。cPLA2缺乏的L929型细胞在TNF表达后则不能积累神经酰胺，这对抗TNF诱导的程序性坏死有保护作用，也为cPLA2在神经酰胺生成和程序性坏死中起着基本作用提供了有力支持。

上述的复合体Ⅱ形成后会导致RIP3的进一步聚集与活化，随后募集RIP3的底物分子混合系激酶区域样蛋白(MLKL)。MLKL羧基端激酶结构域同RIP3结合，氨基端激酶结构域被磷酸化与多聚化，MLKL 通过N端插入膜结构，从细胞质转移到细胞膜及细胞器膜上，形成通透性孔道，破坏生物膜完整性，导致大量离子内流，细胞渗透压过高肿胀而死。

目前已确定的坏死信号下游介质中，活性氧(ROS)是程序性坏死执行中的媒介之一。TNF-α可刺激引导多种细胞产生ROS。一方面 ，ROS会阻断呼吸链质子传递，致使细胞能量代谢障碍而死亡；另一方面，ROS可引起细胞膜脂质过氧化或改变细胞器膜某些通道蛋白功能，如溶酶体受到ROS的损伤后，溶酶体膜通透化(LMP)释放大量溶酶体酶，细胞因此自我消化而亡。端激酶(JNK)通路信号，使用叔丁基羟基茴香醚(BHA)等抗氧化剂治疗可以减少ROS水平，并在一些细胞型中有抑制死亡的作用。

在凋亡过程中，基因翻译、蛋白酶体介导的蛋白质降解等ATP消耗过程被Caspases迅速关闭。然而这些过程在TNF诱导的程序性坏死中却会持续，因此胞内ATP的浓度降低。多聚ADP核糖聚合酶1(PARP1)作为核酶的一种，主要在DNA修复和转录调控中发挥重要作用，过度活化会使ATP耗尽。PARP1参与了纤维肉瘤L929型细胞TNF途径的程序性坏死[15]。其中凋亡诱导因子(AIF)会在PARP1活化后促进下，从线粒体膜间隙向细胞核发生易位，核内有大量的Caspase无关DNA片段。药物和基因抑制PARP1或阻断AIF表达则会有保护细胞免受程序性坏死刺激的作用[16]。腺嘌呤核苷酸转移酶(ANT)和亲环素D(CypD)都参加了线粒体通透性转换的过程，据此推测他们也参与了程序性坏死的过程。CypD消融可通过抑制ATP消耗而保护小鼠避免缺血性肾损伤。研究显示ANT与CypD和电压依赖的阴离子通道(VDAC)相互作用，形成渗透过渡孔复合物(PTPC)[17]。抑制PTPC主要成分形成的药物和基因有VDAC，ANT和CYPD，他们在体内外均通过对抗损伤发挥细胞保护作用。这些结果提示线粒体在程序性坏死中也发挥了重要作用。

1.4 程序性坏死的保护 目前已研发出多种程序性坏死抑制物，如RIP1抑制剂、RIP3抑制剂、MLKL抑制剂等。其中RIP1激酶变构抑制剂(Necrostatin-1)，可特异性抑制RIP1激酶的活性，阻滞对RIP3的募集及两者之间的相互作用。Chen等[18]在MLKL敲除的HT-29细胞中引入带HA标签的MLKL，发现会有内吞MLKL并于溶酶体结合的现象，使MLKL被降解，从而使得细胞得以保护。纯化MLKL定位的细胞膜脂筏结构后可得flotillin-1和flotillin-2，这两种蛋白都与细胞内吞有关，提示针对flotillin-1，flotillin-2可研发新型的程序性坏死抑制剂。

内体分选复合物(ESCRT)-Ⅲ对于胞内运输而言是必需的，而它维持质膜完整性对程序性细胞坏死也有一定的拮抗作用，损伤膜修复当中ESCRT-Ⅲ是不可或缺的重要成分，在实验中诱发MLKL寡聚化同时介导程序性坏死， MLKL激活后的定位恰好位于膜损害之处，在此募集ESCRT-Ⅲ成分，随后将破碎的膜泡主动脱落，以此完成保护程序性细胞坏死[19]。

1.5 其他激活途径 程序性坏死的经典途径是激活TNF，然而细胞表面Toll样受体(Toll-like receptor 1,TLR)及其相应配体，也可以诱发坏死复合体合成，导致细胞程序性坏死。细胞在应激、损伤、感染状态下，TLRs会被病原相关分子触发，若抑制Caspase活性，则脂多糖(LPS)会激活TLR3或TLR4，随后TLR的TIR适配域感受IFN-beta(TRIF)收到相应信号，TRIF包含RHIM结构域，可与RIP1、RIP3结合而诱导坏死，这是一条主要依赖于RIP3激酶的坏死通路。Thapa等[20]在小胶质细胞中也证实了TLR信号对RIP3依赖的程序性坏死有密切联系。

鼠胚胎成纤维细胞中的Caspase-8和FADD缺失后，Ⅰ型、Ⅱ型干扰素均能通过PKR与RIP1结合，然后产生RIP1-RIP3坏死复合体，某些细胞坏死调节可能还涉及到自分泌环路。总之，激活程序性坏死的形式绝不是单一的，但是RIP3激酶的激活，是其共同的关键步骤，含有RHIM结构域蛋白上游信号将RIP3活化后，使其底物MLKL磷酸化来传递坏死信号。

2 程序性细胞坏死与中枢神经系统疾病

2.1 创伤性脑损伤(TBI) TBI是全球死亡或者致残的主要因素。TBI的抢救主要在于减少颅脑二次损伤，目前常用的治疗技术有去骨瓣减压术及低温疗法。大量细胞坏死是TBI致残及死亡的重要原因之一，其中程序性坏死会引起严重组织损伤及功能障碍。nerostatin-1有改善小鼠皮层受控后的功能结构的作用。实验表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Akt信号通路在TBI后会被激活[21]。Akt已知是神经元细胞凋亡抑制剂，而mTOR是Akt下游效应因子。最近研究有报道Akt与mTOR联合抑制降低海马体海马CA3和CA1区域的神经细胞死亡，进而改善小鼠受控皮层影响的功能结构[22]。通过TNF和zVAD(一种Caspase抑制剂)联合诱导海马神经细胞系HT22程序性坏死时，细胞死亡发生在PIPK1-RIPK3-pAKT组装完成及Akt和mTOR磷酸化实现前。Akt和mTOR抑制剂预处理后阻断线粒体ROS产生及程序性坏死的发生，提示Akt/mTOR活化通过诱导致死性氧化应激导致神经元程序性坏死。因此抑制程序性坏死有可能为TBI提供一种新的治疗策略。

2.2 脑肿瘤 脑肿瘤中胶质母细胞瘤占比很重，其侵袭性和致病性都很高但预后差，治疗效果不佳。其抵抗放疗化疗治疗效果可能是由于存在细胞凋亡缺陷。Nomura等[23]发现胶质瘤细胞中紫草素会诱导依赖RIP1的程序性坏死发生。而Huang等[24]进一步发现程序性坏死和凋亡之间有密切联系，将紫草素诱导的程序性坏死会在加入Necrostatin-1抑制剂后转化为凋亡。日本包膜血球凝集病毒(HVJ-E)可诱导人神经母细胞瘤细胞坏死[25]，细胞胞浆中Ca2+调蛋白激酶(CaMK)Ⅱ在Ca2+浓缩时被激活，将RIP1磷酸并产生ROS。

在以5-氨基乙酰丙酸为基础的光动力治疗(5-ALA-PDT)中，将NF-kB抑制后发现程序性坏死在恶性胶质瘤细胞中也有发生[26]。研究显示阿米洛利衍生物5-betaenzylglycinyl-amiloride会诱导胶质瘤产生程序性细胞坏死，此过程不为PARP和H2AX活化所影响[27]。此外发现AMP活化蛋白激酶(AMPK)抑制剂复合物C也有诱导肿瘤发生程序性细胞坏死的作用。以上表面程序性坏死可能会是脑肿瘤潜在的治疗靶点。

2.3 脑血管疾病 脑血管疾病最常见的当属中风，是一种大脑血供应急性障碍疾病，分缺血性和失血性。中风通常导致不可逆的神经死亡以及随后的不良预后。中风发作后脑组织很多生化指标显著异常，提示明显的细胞损伤[28]。缺血性脑损伤与细胞内凋亡信号缺乏导致程序性坏死诱导产生有关[6]。程序性坏死是脑缺血、再灌注损伤中重要的死亡途径。单独使用程序性坏死抑制剂Necrostatin-1或将其与凋亡抑制剂(神经保护肽Gly14)humanin联合使用发现对与氧糖剥夺后诱导的细胞死亡具有保护作用。此外，两种抑制剂的联合治疗可以改善脑动脉堵塞及再灌注的小鼠的神经评分，减少梗死面积。敲除RIP3，或MLKL可以明显的减轻脑缺血导致的皮质神经元死亡[29]。

程序性坏死也参与了脑出血相关的细胞死亡[9]。King等[8]在动物模型中报道了程序性坏死抑制剂Necrostatin-1可以限制细胞死亡，减少血肿体积，改善脑出血后的神经行为表现。Chang等[29]报道称抑制剂Necrostatin-1也可以抑制凋亡和自噬通路，在脑出血小鼠模型中发挥神经保护作用。

2.4 中枢退行性疾病 中枢退行性疾病是一种较为特殊的疾病，其共同特征是结构或功能逐渐衰退，其中含有神经系统中的细胞死亡。一些最常见的神经系统疾病有肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默症(AD)、多发性硬化(MS)等。

ALS特征是上、下运动神经元逐渐退化,通常在确诊后3～5年内由于呼吸无力死于呼吸衰竭。Bertram等[30]将人胚胎干细胞来源的运动神经元(hEs-MNs)与从ALS患者死后11 h内取得的星形胶质细胞共同培养以做建模，在此模型中也发现了ALS中存在运动神经元程序性坏死的证据。

AD是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病，严重的神经元丧失是其主要特征，然而其细胞死亡机制尚不明确。Caccamo等[31]对AD患者尸解发现了明显的程序性坏死特点，其程度与Braak分期、脑质量、认知分数密切相关。同时受RIPK1调控的基因组在多个独立AD转录组的特征有明显重叠。抑制AD小鼠模型中的程序性坏死后，神经元的损失明显减少。

MS是一种炎症性中枢神经系统疾病，脑和脊髓白质的局灶性炎性脱髓鞘和轴突变性，是多发性硬化的主要病理特征，而MS抑制少突胶质细胞死亡及促进其再髓鞘化，是MS患者永久性残疾的重要原因之一。另外，高雪氏病(GD)是一种遗传性代谢疾病，由于葡萄糖脑苷酶基因(GBA)突变而引起的最常见的溶酶体蓄积障碍疾病，其神经元死亡的机制一直不清，近年的研究发现RIP激酶直接参与了GD的病理过程，在 Ripk3-/-GD小鼠模型中小胶质细胞RIP3表达量与病理发展程度密切相关。

程序性坏死是一种可被多种外部刺激所诱发的另一种细胞死亡方式，尤其在凋亡信号被抑制时广泛发生。RIP1-RIP3-MLKL坏死复合体是程序性坏死发生的关键。程序性坏死与许多疾病的发病机制有关。越来越多的证据表明抑制程序性坏死通路，可以在脑损伤等多种脑疾病中起到神经保护作用，这提供了一个很有前景的治疗方向，阻断程序性坏死信号对于防治中枢神经系统疾病有重要意义。