姜莉莉，王开运，武玉国，王开元，王红艳

(1.山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2.山东农业大学 植物保护学院，山东 泰安 271018；3.山东慧泰华生物技术有限公司,山东 泰安 271000)

在我国农业生产中，因长期大量施用化学肥料和连作种植，出现了土壤退化、连作障碍严重、农产品品质下降、生态环境恶化等一系列问题，对食品及环境安全造成严重威胁。在此背景下，生物肥料因环境友好、资源节约、绿色安全等优点而受到广泛关注，在无公害农产品生产中的地位不断提高[1]。有研究报道，生物肥具有速效、长效和改良土壤的作用。同时，生物肥中所含的功能微生物还可将作物难以吸收的固定态养分转化为易吸收的形态，提高养分供应速率[2]。近年来，我国生物肥料研究和产业化发展迅速，产业链基本形成，系统评价生物肥料在耕地质量提升及农产品品质改善中的作用，对我国农业可持续发展和绿色农产品生产意义重大。

丰田宝生物有机肥(含高效固氮菌生物有机肥)是国家“十二五”科技支撑计划中土壤改良项目的发明成果，由高效固氮菌、解磷菌、解钾菌和拮抗菌组成功能菌群，与活化腐殖酸、磷矿粉、钾矿粉等有机载体混合造粒而成。该生物有机肥在番茄、黄瓜、草莓、葡萄等作物上一次性施用，可完全替代化学肥料，同时还可改善农产品外观和口感[3]。然而，该生物肥对作物果实品质的改善效果和土壤微生物群落结构的调控机理尚不清楚。本研究以连续4 a 8次施用该生物有机肥的设施番茄及种植土壤为研究对象，分析其与常规施肥处理的土壤养分和微生物群落差异，探求该肥料提升农田地力的效果及机理；同时比较不同施肥方式对番茄综合品质的影响，为连作土壤的生态改良、生态农业的持续发展和农产品品质的提升提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 供试肥料

丰田宝生物有机肥(含高效固氮菌生物有机肥)，含高效固氮菌、解磷菌、解钾菌和拮抗菌组成功能菌群，与活化腐殖酸、磷矿粉、钾矿粉等混合造粒而成，含活菌数≥0.2亿/g，有机质含量≥40%，氮、磷、钾总含量≤4.0%，由山东友邦肥业科技有限公司生产。对照肥料由农户在当地农资店购置。

1.2 试验设计

本试验共设2个处理，处理1：连续施用丰田宝生物有机肥4 a，每年种植2茬番茄，按500 g/株的剂量穴施后移栽番茄幼苗并覆土，浇透水，番茄整个生长期不再追施任何其他肥料；处理2：常规施肥处理，每年施用腐熟鸡粪60 m3/hm2和复合肥(15-15-15)1 500 kg/hm2，浅翻入土，起垄后移栽番茄幼苗并浇水，待番茄第1批果实采收后追施冲施肥(15-15-15)150 kg/hm2，之后每隔10～15 d冲施1次，至果实采收结束每一生长季节共冲施8次。每个小区面积20 m2、定植80株为1个重复，每个处理重复3次，随机分布，处理间设有1.5 m宽的缓冲带。

1.3 试验操作

试验区设在山东省泰安市岱岳区房村镇西良甫村(N35°57′56.14″, E117°11′23.62″)的设施番茄田，为番茄种植基地核心区，农户已连续种植番茄10余年，管理经验丰富。试验设施为黄淮流域常见的简易土墙日光温室，由于连年施用化学肥料，土壤盐渍化程度较高。每年8月中下旬定植第1茬三叶期番茄幼苗，坐果6层后打顶，次年1月上旬套种第2茬，2月拔第1茬秧，7月拔第2茬秧。2014年8月15日种植第1茬番茄，2018年6月21日末茬拔秧。每茬幼苗移栽前施用2%的吡虫啉颗粒剂预防烟粉虱危害，移栽后30 d内喷施噻虫嗪1次防治烟粉虱，番茄坐果期喷施50%烯酰吗啉·锰锌可湿性粉剂3次，间隔20～30 d，预防番茄晚疫病等病害，日常管理按照当地常规进行。

1.4 样品采集与测定

2018年4月16日，采集末茬第1批番茄成熟果实进行品质测定。每个小区随机挑选9个可商品化果实测量单果质量和果实的横、纵径，并计算果型指数。果实匀浆后，减压干燥测定果实含水量。以NaOH滴定法测定可滴定酸含量。以蒽酮比色法测定可溶性糖含量[4]，钼蓝比色法测定Vc含量[5]，紫外-可见分光光度计法测定番茄红素含量[6]。2018年6月5日(末茬拔秧前期)，每个处理选取20个点，采集5～15 cm土层土壤样品，充分混匀、过筛后分成2份，一份以干冰保存并送样，用于土壤微生物的高通量测定；另一份完全风干，采用常规分析法测定土壤有机质、铵态氮、有效磷、速效钾含量[7]。

微生物群落多样性分析由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

抽提基因组DNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检测。以带有Barcode的515F/907R引物进行PCR扩增，产物以2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并进行凝胶回收。PCR产物经检测定量后，按照测序量要求进行相应比例混合后构建Miseq文库并测序。

Miseq测序得到的PE reads经过拼接、质控和过滤后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU进行多样性指数分析，对测序深度的检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.5 数据处理

数据处理采用Microsoft Excel 2016和SPSS 18.0等软件进行，差异显著性采用Duncan新复极差法进行分析。

2 结果与分析

2.1 连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥对番茄果实品质的影响

由表1可知，连续4 a施用该生物有机肥的番茄果实单果质量、果型指数、含水量与常规施肥处理差异不显著；番茄果实糖酸比4.39，较常规施肥对照3.95提高了11.1%；Vc含量108.2 μg/g，较常规施肥处理100.9 μg/g提高了7.2%；番茄红素含量49.9 μg/g，较常规施肥对照44.4 μg/g提高了12.4%。由此可见，连续施用该生物有机肥，可显著提高番茄果实的糖酸比、Vc和番茄红素含量。同时，连续施用生物有机肥种植的番茄果实果肉为沙性，质地紧实，口感好，表观光亮，商品质量大幅度提高。

表1 连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥对番茄果实品质的影响

2.2 连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥对土壤养分含量的影响

由表2可知，连续施用生物有机肥4 a 8次，番茄种植土壤的铵态氮含量与常规施肥处理间没有显著性差异，表明该肥料中的固氮菌可通过生物固氮完全满足番茄生长所需的氮素供应。同时，连续4 a施用该生物有机肥处理土壤的有效磷、速效钾和有机质含量较常规施肥处理分别显著提高147.0%，38.8%，35.6%。表明该生物肥所含的解磷菌和解钾菌能够高效分解土壤中难溶态磷和钾供植物吸收；而肥料中的腐殖酸、黄腐酸钾等有机载体也可显著提高土壤的有机质含量。

表2 连续施用生物有机肥对土壤养分含量的影响

2.3 连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥对土壤细菌群落组成的影响

由图1可以看出，在属水平上，连续4 a施用该生物有机肥可降低番茄种植土壤溶杆菌(Lysobacter)、节细菌属(Arthrobacter)、硝化螺菌属(Nitrospira)、芽单胞菌(Gemmatimonadaceae)、蓝藻细菌(Cyanobacteria)、黄杆菌属(Flavobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、噬纤维细菌(Cytophagaceae)的相对丰度；提高链霉菌属(Streptomyces)、特吕珀菌属(Truepera)、盐单胞菌(Halomonas)、尿素芽孢杆菌(Ureibacillus)、海源菌(Idiomarina)和芽孢杆菌(Bacillus)的相对丰度。由图2可以看出，在种水平上，连续施用该生物有机肥可显著提高土壤芽孢杆菌中阿氏芽孢杆菌(Bacillusasahii)的相对丰度。

CK.常规施肥处理；FTB.连续4 a施用生物有机肥。图2同。

图2 不同施肥方式土壤细菌种水平差异显著性

2.4 连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥对土壤微生物多样性指数的影响

由表3可以看出，连续施用生物有机肥4 a的番茄种植土壤微生物Coverage和Simpson指数均高于常规施肥对照，Chao和Shannon指数低于常规施肥对照，表明生物有机肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆盖度和优势度。

表3 连续施用生物有机肥对土壤微生物多样性指数的影响

3 讨论与结论

土壤是生态系统中物质循环与能量流动的重要场所，也是微生物参与化学反应的载体[8]。不同的施肥措施对土壤肥力及微生态环境影响较大。许云翔等[9]报道，施用生物炭6 a后，稻田土壤有机碳、有效磷和速效钾含量显著增加，增幅分别为34.6%，12.4%，26.2%。大量研究表明，生物肥料能将土壤中难溶态的养分转化为可溶性养分供植物吸收，既可培肥地力，又能改善农产品品质[10]。库永丽等[11]报道，微生物肥料可显著提高猕猴桃果园土壤细菌、放线菌与真菌的比值，提高土壤肥力；同时，猕猴桃果实的维生素C和可溶性糖含量提高，可滴定酸含量下降。陈龙等[12]报道，微生物肥料替代15%化肥对干旱区玉米生长的影响与当地最佳施肥水平无显著差异，但可改善土壤微生物环境。王文庆等[13]报道，施用0681微生物肥料可以改善土壤微生物菌群结构，增强土壤的持水、缓冲、保肥能力，减轻山药病害发生。Li等[14]报道，生物肥料替代40%的化学肥料可以显著提高土壤有机碳和可溶性有机碳含量，增加土壤中芽孢杆菌、木霉菌和假单胞菌等益生菌的丰度，降低镰刀菌和轮枝菌等病原菌的数量。笔者团队前期报道，施用含高效固氮菌、解磷菌、解钾菌和拮抗菌生物有机肥替代化学肥料，可使设施番茄产量提高18.81%～22.30%[15]，但其对土壤生物学特性的影响尚不清楚。磷和钾是植物生长所需的重要元素，但土壤中95%以上的磷和90%～98%的钾不能被植物直接吸收利用[16]。本研究发现，连续4 a穴施8次丰田宝生物有机肥完全替代化学肥料，可满足番茄生长所需的氮素供应，这可能与高效固氮菌的生物固氮作用有关；还可显著提高土壤有效磷、速效钾和有机质含量，这可能与该肥料中添加的解磷菌、解钾菌及磷矿粉、钾矿粉有关。同时，该肥料也显著提高了番茄果实的糖酸比、Vc和番茄红素的含量，改善了番茄的综合品质。

由于土壤微生物种类繁多、数量巨大，传统的分离培养方法难以全面反映土壤微生物群落结构的实际情况[17]。高通量测序技术为土壤微生物多样性分析提供了极大的技术支持。任天宝等[18]采用高通量测序技术研究表明，以生物炭处理的植烟土壤放线菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、装甲菌门(Armatimonadetes)的群落丰度明显提高。本研究采用高通量测序技术分析发现，常规施肥处理的番茄种植土壤中硝化螺菌的相对丰度较高，可能与化学氮肥的大量施用有关[19]，导致部分铵态氮转化为硝态氮；溶杆菌和芽单胞菌相对丰度较高，可能是由于其与硝态氮呈正相关[20]；噬纤维细菌的相对丰度较高，这可能与鸡粪中纤维素含量较高有关[21]。连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥处理的番茄种植土壤链霉菌属相对丰度较高，可能是由于其与土壤有效磷呈正相关[19]；特吕珀菌属、尿素芽孢杆菌和芽孢杆菌的相对丰度较高，表明该生物肥可提高土壤益生菌的相对丰度[22-23]，其中对阿氏芽孢杆菌的提高效果最为显著，这与Wang等[24]报道的以海藻肥替代化学肥料种植番茄可显著提高土壤阿氏芽孢杆菌相对丰度的结果一致。Feng等[25]也报道，土壤阿氏芽孢杆菌对有机肥处理的反应最直接，其需要2～4 a的时间演变成为土壤优势种群，土壤阿氏芽孢杆菌相对丰度的提高对作物产量和土壤肥力的提高具有重要意义。由此可见，连续4 a施用含高效固氮菌生物有机肥可提高土壤益生菌的相对丰度，改良土壤微生态结构，有利于番茄健壮栽培。

微生物群落结构可通过多种指数进行表征[26]。Chao指数是主要用于估计群落样品中包含的物种总数。Coverage指数是一个较为常用的测序深度指数，其在计算中加入了只含有1条序列的OUT数目和抽样中出现的总序列数目，能较为真实的反映样品的测序深度。Shannon指数考虑到样品中的分类总数和每个分类所占的比例，群落多样性越高，物种分布越均匀，Shannon指数越大。Simpson指数通过计算随机取样的2个个体属于不同种的概率，来表征群落内物种分布的多样性和均匀度[27-28]。提高微生物群落的多样性有助于提高土壤生态系统的生产力、稳定性和可持续性[29]。本研究发现，连续施用该生物有机肥4 a的番茄种植土壤，其微生物Coverage和Simpson指数均高于常规施肥对照，Chao和Shannon指数均低于常规施肥对照，表明该生物有机肥可在一定程度上提高土壤微生物的覆盖度和优势度。