陈艳杰

摘 要：通过多元统计分析测定银杏叶提取物中部分有机酸成分含量。方法 采用色谱柱法等对9种小分子有机酸进行分离，保持柱温40℃对有机酸含量进行线性关系考察，得到银杏叶中几种不同小分子有机酸含量;利用多元统计分析对试验结果进行验证，得到各待测成分之间的标准曲线、相关系数等;利用方法学进行精密度、稳定性、重复性、准确度试验，明确试验所得结论的科学性。结果 相同银杏叶产区不同厂家所生产的银杏叶提取物主成分含量存在差异;利用多元统计分析可以对成分差异以及内在相关性进行解读，认为儿茶素、没食子酸、原儿茶酸等是体现不同厂家银杏叶提取物小分子有机酸含量差异的主要特征成分。

关键词：多元统计分析;银杏叶提取物;小分子有机酸;色谱柱法

中图分类号：TU528.59 文献标识码：A     文章编号：1001-5922（2021）12-0039-05

Determination of 9 Kinds of Small Molecular Organic Acids in Ginkgo Biloba Extracts by HPLC

Chen Yanjie

（Zhengzhou University of Industrial Technology， Zhengzhou 451150， China）

Abstract：Multivariate statistical analysis is adopted to determine the content of some organic acids in the Ginkgo biloba extracts. Chromatographic column is used to separate nine kinds of small molecular organic acids， and the column temperature is controlled at 40℃ to investigate the linear relationship of organic acid content. Thus the contents of several different small molecular organic acids in ginkgo biloba are obtained. Multivariate statistical analysis is utilized to verify the test results， and the standard curves and correlation coefficients of each component to be measured are obtained. The methodology is carried out to test the precision， stability， repeatability and accuracy， which clarifies the scientificity of the conclusions obtained from the tests. The results show that the main component content of ginkgo biloba extracts from the same region produced by different manufacturers is different. Multivariate statistical analysis can be used to interpret the components differences and their internal correlation， and it is believed that catechin， gallic acid， protocatechin acid and others are the main characteristic components reflecting the differences of small molecular organic acid content in ginkgo biloba extracts from different manufacturers.

Key words：Multivariate statistical analysis; Ginkgo biloba extracts; Small organic acids; Chromatographic column

0 引言

銀杏叶提取物的主要成分包含了银杏黄酮醇苷和萜类内酯类成分等，其可以通过调节人体血脂等对人体血管进行软化、保护等。银杏叶提取物不仅对心、肾、脑，血管具有保护作用，同时对4肢的血管也具有保护作用，并且可以改善某些患者的临床症状。然而，银杏叶的有效成分较为复杂，除提到的两种有效成分外，据不同学者研究表明，其内部成分至少有160多种有机酸、酚类物质还可以发挥保健或药用效果。因此，针对银杏叶提取物进行成分分析，始终是银杏产业、医疗保健产业高度关注的研究方向。

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）又称高压液相色谱，是一种以待检测液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分离和分析的方法[3]。利用HPLC法测定液体成分，具有分离效能高、分离灵敏度高、分析速度快等优势。因此，本文利用该法对银杏叶提取物有效成分含量进行分析，对银杏叶提取物中的9种小分子有机酸含量进行分析，通过不同品牌银杏叶提取物对比得出银杏叶提取物较为理想的配伍方式。

1 材料与方法

1.1 实验材料与设备

本文进行银杏叶提取物成分含量分析，主要目的是确定不同品牌银杏叶提取物中各小分子有机酸成分含量[4-5];采用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）主要依赖高效液相色谱仪实现，该仪器通常包含四元泵溶剂系统、自动进样器等设备。此外，本文在试验中，还需要依赖超声波清洗剂、超纯水仪等设备，对提取物進行除污以及提供优质水环境等。

银杏叶提取物中的9种小分子有机酸主要指的是：①儿茶素（C15H14O6H2O），又名儿茶酸可以防治心血管疾病、预防癌症等;②没食子酸[C6H2（OH）3COOH]，属于有机酸，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等功能;③原儿茶酸[（HO）2C6H3COOH]，又名3，4-二羟基苯甲酸，临床用于治疗慢性气管炎具有一定的抗菌作用;④6-羟基犬尿喹啉酸亦称犬尿喹啉酸，与白细胞跟内皮细胞结合的调控密切相关;⑤莽草酸（C7H10O5），能够有效抑制血小板聚积，对人体而言具有抗炎、镇痛作用;⑥表儿茶素（C15H14O6），是一种有效的抗氧化剂，同时也能够有效清除人体自由基;⑦对羟基苯甲酸（C7H6O3），可抑制霉菌的生长;⑧对羟基肉桂酸（C9H8O3），有很强的生物活性，对人体而言就有抗氧化、抗肿瘤、抗化疗升白等作用;⑨咖啡酸（C9H8O4），对人体有较明显的抑菌和抗病毒活性作用[4-6]。本文将会选择国内外8家企业对外公开销售的若干类银杏叶提取物产品作为对照组，以本试验自配的银杏叶提取物为实验组，重点针对银杏叶提取物中这9种小分子有机酸含量进行分析。

1.2 试验过程

第1步，将购买的8家企业对外销售的45批次银杏叶提取物分别进行命名，如表1所示;第2步，精密提取9种小分子有机酸并加入质量分数80%的甲醇溶液，制成混合物对照组;第3步，对提取物进行精密度、稳定性、重复性实验等，得到初步试验结果;第4步，对试验样品进行直观分析、聚类分析、主成分分析等，得到9种有机酸成分之间的相关性分析结果。

1.3 试验方法

本试验成功的关键在于对高效液相色谱仪、流动相梯度洗脱成分的控制。本文选择了日本岛津出产的GL Inertsil ODS-3色谱柱（色谱柱参数：250 mm×4.6 mm，5 μm）进行试验分析;试验中的流动相选择不同质量分数的乙腈（C2H3N）溶液搭配质量分数为0.4%的磷酸缓冲溶液;梯度洗脱时保持体积流量1 ml/min，柱温40℃，进样体积为10 μl。表2为梯度洗脱环节的参数设置情况，试验开始至8 min时，以质量分数5%～6%的C2H3N溶液搭配质量分数为0.4%的磷酸缓冲溶液进行洗脱;在8～13 min时，以质量浓度为6%的C2H3N溶液搭配质量分数为0.4%的磷酸缓冲溶液进行洗脱;以此类推，最终得到不同洗脱梯度状态下的色谱柱数据。

本试验成功的关键在于对高效液相色谱仪、流动相梯度洗脱成分的控制，表2所示为高效液相色谱仪以及梯度洗脱等环节的参数控制。

1.3.1 线性关系考查

通过精准配备相关混合溶液按照表2所示的参数控制情况进行色谱条件测定，以本文自制的对照组溶液质量为 x 轴，以其中9种小分子有机酸在色谱柱中表现出的波峰面积为 y 轴，通过绘制银杏叶提取物中待测成分的标准曲线得到表3所示各成分的相关系数、线性范围、检测限、定量限等参数。

1.3.2 方法学考查

本文在方法学视角将会采用精密度实验、稳定性试验、重复性实验以及准确度试验，分别对试验环境所用仪器、实验样品溶液稳定性、实验方法重复性以及实验准确度进行验证[7-9]。验证结果表明，本文所采用的实验仪器精密度、稳定性良好，可以进行重复实验。同时，几种小分子有机酸的回收率基本均超过99%，具有较好的准确度。

2 实验结果与分析

2.1 样品直观分析

取表1中45批次样品各1份，进行高效液相色谱仪分析，按照表2的参数控制情况分别测定各样品中9种小分子有机酸的总质量分数，得到45种样品中有机酸总质量分数，具体结果如表4所示。

从表4的结果来看，8个厂家所生产的45批次银杏叶提取物产品中9种小分子有机酸总质量分数值并不相同，D厂家所生产的银杏叶提取物9种小分子有机酸总质量分数最高;而H厂家所生产的银杏叶提取物9种小分子有机酸总质量分数最低，且差距超过21 mg/g。但是，这种总成分分析法并不能明确得到试样中各有机酸之间的质量差异情况，还需要对各试样进行主成分分析等过程。此外，利用SPSS22.0对45份溶液进行聚类分析，根据聚类分析结果显示，只有D厂家生产的产品可以单独聚为一类，其他厂家的各类型产品均可聚为一类。可见，D厂家在生产银杏叶提取物产品时所采用的配方明显与其他厂家之间存在较大的差异。但造成差异的具体原因还需要进行详细的分析。

2.2 主成分分析

再次利用SPSS 22.0对45份溶液进行主成分分析。主成分分析是在尽可能保持原有数据信息的前提下，通过n次分析和降维处理，对海量数据指标进行简化处理方法。本文在对45份溶液进行6次主成分分析以后得到表5所示样本中主要成分的特征值和方差贡献率。

由表5的主成分特征值和方差贡献率分析得到了6组试验结果，但若针对6组数据进行载荷因子筛选，还是要进行大量的计算。为此，仍然需要将6组试验结果进行简化。根据方差贡献率取样理论要求，只要主成分方差贡献率大于等于85%，即可认为该次主成分分析具有统计学意义。因此，本试验认为选择前两次主成分分析结果即可表征全部样品信息。将表5前两组数据进行载荷因子筛选，得到旋转变换以后的因子矩阵，具体结果如表6所示。

由表6可知，以上9种小分子有机酸载荷因子旋转变换以后，只有儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸在第1次主成分因子分析上表现出明显的高载荷特征（载荷绝对值>0.9）;而在第2次主成分分析中，所有有机酸均没有表现出明显的高载荷特征。因此，本文主要参考第1次主成分因子分析结果，该结果表明儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸这4种有机酸是不同溶液样品内部成分质量差异的主要特征成分;换言之，这4项指标是最能够直接体现不同品牌银杏叶溶液中有机酸含量差异的4项指标。可见，只有这4种元素能够明显影响8个厂家45批次银杏叶提取物质量差异，且这4种化合物之间具有密切的相互联系。

对表6中第1次主成分分析数据进行相关性检验，筛选出8种有机酸之间的相关性，从而探讨不同有机酸成分之间的内在联系，揭示银杏叶提取溶液趋于共性的有机酸组成信息特征。检验结果显示，儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸这4种有机酸之间具有显著的正相关性，表明这4种有机酸的含量之間存在明显的密切关系，基本上某一种酸含量的提升都能表明另外3种酸含量的同步提升。

2.3 回收率实验

加样回收实验取本品已知的含量、同一批号样品的几种，精密称定，置100 ml量瓶中，分成两组加入对照品溶液适量，分别按供试品溶液制备方法制得两种供试品溶液，按含量测定方法进行实验，计算回收率，变异系数均小于3%。结果表明。本试验方法回收率较高，此方法可行。

3 结果与讨论

3.1 结果

银杏叶片用于瘀血阻络引起的胸痹心痛、中风、半身不遂、舌强语謇;以及冠心病、稳定型心绞痛、脑梗死具有上述证候者[10]。本文针对市面上8个厂家共计45批次的银杏叶提取物有机酸含量进行分析，结果表明：D厂家生产的产品在配方方面具有明显区别于其他厂家的特征，其9种小分子有机酸质量分数远超其他7个厂家。通过主成分分析表明：儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸这4种有机酸能够影响银杏叶溶液中酸类总量的4项指标因素。因此，本文认为造成不同厂家有机酸含量差异的直接原因，是D厂家儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸这4种有机酸质量分数明显超过其他7个厂家所致。

3.2 讨论

首先，儿茶素、没食子酸、原儿茶酸以及6-羟基犬尿喹啉酸4种有机酸是影响银杏叶提取物有效成分的主要因素，厂家在生产相关产品时应格外强调这4类物质的配比以及内部相关关系，根据产品的不同功效酌情调整产品配比;其次，本文采用HPLC法测量银杏叶提取物中9种小分子有机酸含量，能够从直观（总含量分析）和微观（主成分分析）两个视角对提取物进行成分分析，得到的结果具有直观、高效的效果。且能够利用SPSS22.0得到不同有机酸之间的线性关系，能够为厂家生产同类型产品提供借鉴。

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