杨 斌，杨 瑞，周路敏，张振辉，冯 巍，赵贵森

食管癌(esophageal cancer,EC)是威胁人类健康和生命的主要恶性肿瘤之一[1]。早干预、早发现是EC防治的关键。我国人口基数大，只有集中资源于高危人群，进行精准干预、精准筛查，才能保证防治的社会效果[2-5]。因此，准确地识别高危人群，是高效防治的前提。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点rs671，是识别EC高危人群最有价值的遗传标记[6]。rs671在乙醛脱氢酶2(aldehydedehydrogenase2,ALDH2)基因的编码区内，有2个等位基因(G、A)，3种基因型(GG、GA、AA)。等位基因A主要见于东亚人群，与食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)密切相关[6-9]。GA型个体的酶活性显著降低，ESCC风险增加7倍多。SNP rs 671与其他ESCC风险因素还有很强的交互作用。在饮酒人群中，GA型/GG型的比值比(odds ratio,OR)可高达13.5，群体归因危险度(population attributable risk,PAR)超过50%[8-10]。SNP rs 671与多种其他肿瘤和心血管疾病也有密切的联系[11-14]。

鉴于ALDH2 rs671的重要影响，对其分型方法的研究由来已久，可分为表型分型、基因分型两大类[15]。前者如酒精斑贴试验、面红反应问卷、呼气试验等，简单易行，但影响因素多，易漏检。基因分型法准确、可靠，但成本高、操作复杂，大规模应用受限[16-18]。本研究把LATE(Linear-After-The-Exponential)-PCR非标探针技术和链融解曲线分析法(melting curve analysis,MCA)结合起来[19-26]，从模板提取、PCR扩增、分型等方面对rs671位点的基因分型法进行改进，旨在简化操作、降低成本，为EC高危人群筛查、法医嫌疑人排查等大样本分析提供合适的方法。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与样品

Rotor-Gene Q 5Plex HRM荧光定量PCR仪(德国QIAGEN)，微量紫外可见分光光度计(杭州晶飞)，高速台式离心机(上海安亭)；热启动Taq DNA聚合酶(加拿大Fermentas)，20×Eva Green荧光染料(美国Biotium)；本实验室保存、SNP rs671基因型已知个体的口腔拭子[26]，GG、GA型各5人份，AA型2人份，用Chelex 100法提取基因组DNA，冷藏备用。

1.2 方法

从Genebank中获取SNP rs671序列，用Primer Premier 5.0软件设计引物和探针(表1)[22]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

PCR反应体系25 μL，内含引物和探针适当浓度(表1),dNTP 0.25 mmol·L-1，MgCl212.5 mmol·L-1，10×Buffer 2.5 μL，热启动Taq DNA聚合酶1 U和模板DNA 2 μl，1×Eva Green荧光染料。在Rotor-Gene Q 5Plex HRM荧光定量PCR仪上顺次进行扩增和MCA/HRM分析。循环参数：94 ℃ 8 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 15 s，10个循环；86.5 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，30～50个循环；98 ℃ 1 min，45 ℃ 5 min。MCA/HRM分析：从47 ℃开始，逐步升高温度至92 ℃，每步上升0.1 ℃，Green/HRM通道采集荧光信号。Rotor-Gene 2.0.2.4软件分析数据生成MCA/HRM图谱，根据已知对照基因型数据自动判读待测样品基因型。

表1 引物与探针

2 结果

2.1 LATE-PCR靶片段单链制备

以设计的不对称引物为基础，经优化引物等体系成分的浓度、比例以及循环参数，可以得到典型的LATE-PCR扩增曲线(图1A)，实现了靶片段先双链指数扩增、后单链线性扩增的设计目标，最终得到较多可供杂交的单链片段。终产物直接进行MCA分析，融链峰形态与目标片段双链的预期解链特征一致(图1B)。根据预实验情况，在十几个循环后，降低变性温度至86.5 ℃，可以抑制非特异性产物，同时有利于聚合酶活性的保持，合成更多的单链[27]。

A：在经过短暂的指数增长期后，进入单链合成期，荧光信号保持稳定；B：产物中的双链部分在85 ℃左右融解；S1、S2、S3分别以3种SNP型的样品DNA为模板，每种重复2次；NC为空白对照不加模板；纵坐标dF/dT为导数，即荧光强度随温度升高而下降的速率。

2.2 PCR产物直接MCA/HRM分型

鉴于本研究设计的扩增片段只有71 bp，预期其中单个碱基变异即会对解链温度造成可识别影响，并依此来进行分型[28-30]。作者首先检验了LATE-PCR产物中的双链部分直接MCA/HRM分型的可行性，结果见图2。可见靶片段有两个融链区，GG型的两个峰温度均高于A型携带者，可以较为明显的与非GG型区分开来。AG型与AA型之间的温度差异较小，在模板DNA质量均一性较差时可能会导致误判。结合峰宽、峰位(温度)、肩峰(HMA峰)等特征，或者采用高分辨率融解曲线 (high resolution melting,HRM)模式分析，可以提高AG型识别准确率。

纵坐标dF/dT为导数，即荧光强度随温度升高而下降的速率；AA、AG、GG为曲线代表的rs671位点SNP型。

2.3 非封闭探针分型

非封闭探针P-A和P-G，由25 bp基因序列和3’末端的3个额外添加组成，理论上不能被聚合酶有效延伸，可以在PCR前加入体系。但由于基因组序列和PCR过程的复杂性，这种3’末端不封闭的、较长的探针不适合在PCR前加入。在LATE-PCR后，用P-A探针可以区分A型携带者与GG型(图3A)，用P-G探针，可以区分G型携带者与AA型(图3B)。但应该是受人为引入错配的影响(表1)，P-G探针杂交融链信号偏弱。两个探针合用，可以实现3种基因型准确分型。在食管癌高危人群筛查时，仅用A型探针即可达到目的。但需要二次操作，打开扩增后PCR管子，操作繁琐且有污染的风险[25]。

A：A型探针；B：G型探针；AA、AG、GG为曲线代表的rs671位点SNP型；纵坐标dF/dT为导数，即荧光强度随温度升高而下降的速率。

2.4 封闭探针分型

鉴于上述非封闭探针的不便性，本研究设计了较短的、3’末端C6用氨基修饰封闭其延伸活性的探针，Pm-A、Pm-G。这种探针只有15 bp，退火温度较低，与PCR退火温度相差大，且不能被酶促延伸。因而可以在PCR前加入体系，实现全程的闭管操作，降低污染风险。只用一条探针Pm-G，HRM模式下即可实现3种基因型的区分(图4A、B)。两个探针合用，可以相互印证分型结果(图4C、D)。在HRM模式下，3种基因型区分度高，抗干扰能力强，盲测判型准确率100%[28-30]。

A：A型探针，HRM校准曲线；B：A型探针，HRM差异曲线；C：G型探针，HRM校准曲线D：G型探针，HRM差异曲线；AA、AG、GG为曲线代表的rs671位点SNP型。

3 讨论

全球每年新增和死亡的食管癌患者均高达50万。患者的5 a存活率仅有15%～25%，但早期EC的生存率可达80%以上[1]。通过内镜筛查，早发现、早诊断、早治疗可以大幅提高EC生存率。但是如果仅依赖内镜，平均每筛查到1例早期EC的社会成本超过15万元[2]。因此，必须先锁定高危人群，然后再用内镜进行精准筛查[3-7]。

个体的食管癌易感性与环境和遗传均有关系，以酗酒和ALDH2基因变异最有代表性。二者均为EC的危险因素，并且有很强的交互作用[6-8]。PAR分析表明，如果没有rs671变异，饮酒者可减少约50%发病。另一方面，rs671等位基因A携带者，避免饮酒可大幅降低患EC风险[7-10]。筛查ALDH2 rs671变异型，在当前我国EC防治中降低发病率和死亡率两个方面都有重要意义[9，15]。

方法的简便性、经济性，在大规模人群筛查中，至关重要[15-16]。本研究立足DNA分型，在保证准确可靠的前提下，从样品、提取、PCR和分型等多个环节进行改进，以适应大样本排查要求。本研究以口腔拭子或唾液斑为检验对象，易于接受、便于推广，样品采集和保存方便。在DNA提取方面，借用法医DNA的chelex法，单管即可完成模板制备[26]。用LATE-PCR非标探针技术，把扩增和分型集成起来，不需要酶切、电泳等繁琐操作，不需要引物探针的荧光标记，并且有多种分型策略可供选择[19-22]。

在模板均匀良好的临床研究中，或对已制备好的大样本DNA分型时，可采用直接MCA/HRM，不需要探针，甚至不需要后继线性单链扩增，即可实现A型携带者快速、经济筛查。在样品、模板有一定挑战性，又没有高性能HRM设备时，可以采用非封闭探针法。虽然需要探针使用和相应操作，但应用本研究P-A型探针，可以保证分型相对经济和准确。在需要明确分清3种基因型，对准确度、环境要求高时，可用3’末端C6氨基修饰封闭的探针，直接加入PCR体系，简化操作，降低污染机会。

综上所述，LATE-PCR结合非标探针技术，可以实现SNP rs671的简便、快速、闭管分型，预期在食管癌等疾病高危个体的筛查、酒精敏感个体筛查，药效预判/个性化用药，以及法医嫌疑人排查等多个领域，有较好的应用前景。当然，本方法目前还仅限于单个SNP位点的探索，下一步如能同时分析乙醇脱氢酶2(alcohol dehydrogenase 2，ADH2) rs1229984、直接免提取扩增、增加内标质控等，将更具实用意义。