刘 丽 郇延军 刁欣悦 马 菲

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

苦肠俗称肠皮，是猪小肠洗净刮掉内层油脂、黏膜，取其最外层而得到的具有韧性的一层皮，是猪小肠加工肠衣、肝素钠的副产品，营养丰富，口感劲道，回味苦，是一种高蛋白低脂肪食物，一般用作炒菜、制作苦肠卷等，其具有独特的风味。苦肠的营养价值很高，含有丰富的胶原蛋白。胶原蛋白是一种天然高分子功能性蛋白[1]，在人体皮肤中，可与水结合，能够保水保湿，使皮肤富有弹性，有利于上皮角细胞的增生修复，延缓皮肤的衰老[2-4]，因此，胶原蛋白作为促进组织愈合的伤口敷料[5]、可降解或可食性胶原膜[6]、保健食品等被广泛应用于医疗、保健、食品及美容产品等领域[7-8]。苦肠脂肪含量较低，因此在食用时感觉不太肥腻，随着生活质量的不断提高，人们对于健康的饮食愈发重视，也越来越青睐低脂食品，苦肠的低脂肪含量，使其具有较高的食用价值及巨大的市场潜力。

苦肠中产生苦味的主要成分是胆汁酸。猪小肠在消化吸收时所产生的消化液中含有胆汁，胆汁是由肝细胞产生的具有苦味的有色液体，能促进脂肪消化，其主要的苦味成分是胆汁酸[9]。胆汁酸随胆汁流入肠道后约有95%被肠壁重新吸收，进行胆汁酸的肝肠循环[10-11]。由于胆汁酸无法完全被吸收，导致猪小肠中含有残留的胆汁而使猪小肠苦味明显，严重影响猪小肠及其加工产品的食用口感。

目前关于食物苦味的脱除方法有：酶法[12]、包埋法[13-14]、微生物发酵法[15-17]、超声法[18]、吸附法[19]等。胆汁中产生苦味的主要成分是胆汁酸，难溶于水，难以用水洗净。目前对于苦肠中苦味物质的脱除方法，国内外并未见相关报道。针对苦肠中的苦味成分胆汁酸的化学结构特征，研究拟从分子水平进行探讨，利用小苏打、苏打与胆汁酸发生反应以及胶原蛋白在碱性条件下的溶胀作用，通过单因素试验和Box-Behnken 响应面分析探索小苏打和苏打添加量、作用时间、作用温度对苦肠脱苦效果的影响，旨在优化得出适宜于生产推广的苦肠碱法脱苦最优工艺条件，以期为苦肠的综合利用提供参考，进一步指导生产应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苦肠：南通天龙畜产品有限公司；

小苏打、苏打：食品级，吉林省杞参食品有限公司；

猪总胆汁酸试剂盒：武汉纯度生物公司。

1.2 主要仪器设备

恒温水浴锅：HH-S型，郑州长城科工贸有限公司；

离心机：SIGMA2-16K型，德国西格玛公司；

酶标仪：BioTek Synergyh1型，美国Biotek公司；

智能生化培养箱：SPX型，南京金恒实验仪器厂；

均质器：VOSHIN-600R型，无锡沃信仪器有限公司；

扫描电子显微镜：su1510型，日本日立株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备 挑选苦肠原料，剔除可见的脂肪、黏沫等杂质，用水清洗至水澄清，沥干水分，切成1～2 cm的小段，准确称取20 g苦肠，按照一定比例添加小苏打或苏打揉搓混匀，在一定温度下脱苦处理一定时间后，用清水按照肠水比(m苦肠∶V水)1∶5 (g/mL)的比例进行揉搓，冲洗5次，以去除多余的小苏打或苏打，沥干后即得待测的苦肠样品。

1.3.2 单因素试验设计

(1) 小苏打添加量：分别取小苏打添加量为1%，2%，3%，4%，5%，6%，在作用时间50 min，作用温度20 ℃ 的条件下进行脱苦处理，以胆汁酸脱除率和苦味值为评价指标，研究小苏打添加量对脱苦效果的影响。

苏打添加量：分别取苏打添加量为0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，在作用时间50 min，作用温度20 ℃的条件下进行脱苦处理，以胆汁酸脱除率和苦味值为评价指标，研究苏打添加量对脱苦效果的影响。

(2) 小苏打作用时间：在小苏打添加量为5%，作用温度为20 ℃的条件下，分别作用10，20，30，40，50，60 min，以胆汁酸脱除率和苦味值为评价指标，研究小苏打作用时间对脱苦效果的影响。

(3) 小苏打作用温度：选择作用温度10，20，30，40，50，60 ℃，小苏打添加量为5%，作用时间为50 min，以胆汁酸脱苦率和苦味值为评价指标，研究小苏打作用温度对脱苦效果的影响。

1.3.3 响应面分析试验 根据Box-Behnken试验设计原理，以添加量、作用时间和作用温度为自变量，以胆汁酸脱除率和苦味值为响应值，对苦肠的脱苦工艺进行优化，并进行验证实验。

1.3.4 相关指标的测定

(1) 胆汁酸含量：采用ELISE酶联免疫法[20]。测得胆汁酸标准曲线如图1所示，标准曲线方程为Y=0.089 6X+0.011 9，R2=0.999。

图1 标准曲线图Figure 1 Standard curve

胆汁酸脱苦率计算公式为：

(1)

式中：

D——脱苦率，%；

C0——苦肠中胆汁酸含量，μmol/g；

C1——脱苦后苦肠中胆汁酸含量，μmol/g。

(2) 感官评定：挑选10名(5男5女)经过培训的人员组成评定小组，严格根据表1感官评定标准进行脱苦前后苦肠的感官评价，以100分记。

表1 感官评定标准表Table1 The sensory evaluation standard

(3) 微观结构：参照Birna等[21]的方法。

1.3.5 数据分析 每个试验设3个平行，结果取平均值。采用Design-expert 8.0.6统计软件进行响应面试验结果分析。采用OriginPro 8.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 添加量对脱苦率和苦味值的影响 由图2、3可以看出，在一定范围内，当增加小苏打、苏打的添加量时，会使得脱苦率发生改变，并呈增大的趋势，但是添加小苏打、苏打达到一定的值时，脱苦率达到最大，之后随着小苏打、苏打添加量的增多，脱苦率呈下降趋势。感官评定表明，当小苏打添加量为4%、苏打添加量为0.2%时，苦肠苦味较淡；继续增加小苏打、苏打添加量，苦肠的苦味逐渐增加。随着小苏打、苏打的添加，酸碱发生反应，使得脱苦率下降，苦味值降低，当碱添加过多，可能由于胶原蛋白变性形成凝胶，抑制了分子流动速率，反应速度下降，导致脱苦率下降，苦味值上升。综合考虑脱苦率和感官评定结果，选择小苏打的添加量为3%～5%进行后续研究。

图2 小苏打添加量对脱苦率和苦味值的影响Figure 2 Effect of the amount of baking soda on debittering rate and bitterness value

图3 苏打添加量对脱苦率和苦味值的影响Figure 3 Effect of the amount of soda on debittering rate and bitterness value

2.1.2 作用时间对脱苦率和苦味值的影响 由图4可知，小苏打对苦肠中胆汁酸的脱除率随碱作用时间的延长而逐渐改变。胆汁酸的脱除率随时间的延长而逐渐增加，当作用时间达到一定值时，胆汁酸的脱除率随时间的延长而趋于稳定。感官评定表明，当小苏打作用时间达到40 min时，品尝脱苦后的苦肠口感上已无明显苦味。作用时间过短，碱与胆汁酸无法充分反应，达到最佳的脱苦效果，当反应充分后，继续增加时间，其反应不再进行，脱苦率、感官评定也趋于稳定。综合考虑脱苦率和感官评定结果，确定以30～50 min作为脱苦作用时间进行后续研究。

图4 小苏打作用时间对脱苦率和苦味值的影响Figure 4 Effect of baking soda action time on debittering rate and bitterness value

2.1.3 作用温度对脱苦率和苦味值的影响 由图5可知，当作用温度低时，苦肠中胆汁酸的脱除率随温度的增加而逐渐增加，当温度大于一定值后，脱除率出现下降的趋势。感官评定表明，当小苏打作用温度达到40 ℃时，品尝脱苦后的苦肠苦味较淡，但随着作用温度的增加，苦肠的苦味逐渐增加。这可能是由于随着温度的升高，反应速度逐渐增大，脱苦率逐渐增大，温度继续升高，蛋白质受热发生变性，螺旋结构逐渐打开成链，蛋白质分子之间的交联度增加，形成网络结构，抑制了反应的进行[22]。综合考虑脱苦率和感官评定结果，确定以30～50 ℃的作用温度进行后续研究。

图5 小苏打作用温度对脱苦率和苦味值的影响Figure 5 Effect of baking soda temperature on debittering rate and bitterness value

2.2 响应面优化分析

2.2.1 苦肠脱苦工艺参数优化 根据单因素试验结果，以脱苦率和感官评分为响应值，进行响应面试验设计，设计因素水平如表2所示，试验设计及结果如表3所示。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiment

表2 响应面试验因素水平表Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2.2.2 模型方差分析 通过软件分析得到脱苦率的回归方程为：

Y1=40.23-1.29A+2.52B-0.057C+0.77AB-2.13AC-1.13BC-4.81A2-3.74B2-3.98C2。

(2)

苦味值的回归方程为：

Y2=17.56+1.74A-13.37B-0.94C-1.31AB+3.67AC-2.10BC+7.18A2+9.57B2+11.51C2。

(3)

由表4、5可知，脱苦率、苦味值2个模型P值均小于0.01，故该试验方案采用的二次多项模型有着极高的显著性；各模型失拟项P值分别为0.861 3和0.052 9，表明其结果不显著，有较好的模型拟合度；各模型的R2均接近1，表明试验数据与模型有良好的拟合度[23]，可以用回归方程表达真实值进行分析[24]。

表4 回归模型方差分析(以脱苦率为响应值)†Table 4 Variance analysis of the regression model (Debittering rate as response value)

2.2.3 响应曲面分析

(1) 脱苦率响应面分析：由图6可知，添加量、作用温度和作用时间对脱苦率影响较为明显，交互项AB、AC、BC对脱苦率的影响均极显著(P<0.01)。

图6 三因素对脱苦率影响的响应曲面Figure 6 Effect of three factors on the response surface of debittering rate

(2) 感官评定响应面分析：由图7可知，添加量、作用温度和作用时间对苦味值影响较为明显，交互项AC、BC对苦味值的影响极显著(P<0.01)，交互项BC对苦味值的影响显著(P<0.05)。

图7 三因素对感官评定影响的响应曲面Figure 7 Effect of three factors on the response surface of sensory evaluation

2.2.4 最佳工艺参数的优化及验证 综合脱苦率和苦味值参考指标，通过Design-expert 8.0.6软件确定最终的脱苦参数为：小苏打添加量3.91%，作用时间40.2 min，作用温度45 ℃。考虑到实际生产，将参数修整为小苏打添加量4%，作用时间40 min，作用温度40 ℃。采用上述参数进行3次验证实验，其平均脱苦率为40.47%，感官评定为14.03。进而证明响应面优化模型预测值较为可靠。

表5 回归模型方差分析(以感官评定为响应值)†Table 5 Variance analysis of the regression model (Sensory evaluation as response value)

2.3 脱苦处理对苦肠成分的影响

从表6可以看出，苦肠经碱法脱苦处理，水分含量由80.74%上升到84.19%，蛋白质、胶原蛋白、脂肪含量略有下降，因此苦肠的碱法脱苦对苦肠成分的影响不大。

表6 脱苦前后苦肠成分的变化Table 6 Changes in the composition of bitter intestines before and after debittering %

2.4 脱苦处理对苦肠微观结构的影响

由图8可知，未处理的苦肠纤维紧密严实，表面平整光滑，没有裂缝和空洞。经小苏打脱苦处理后肌原纤维出现变化，纤维之间空洞变大，肌束膜溶解，肌纤维出现了断裂，空间和结构变得疏松，肌束变得更加混乱[25]。

图8 脱苦处理对苦肠微观结构的影响

3 结论

通过单因素试验研究了小苏打和苏打对苦肠脱苦效果的影响，通过响应面分析确定了小苏打对苦肠的最佳脱苦工艺条件为：小苏打添加量4%，作用时间40 min，作用温度40 ℃，此条件下苦肠脱苦率达40.47%，苦味值由89.16降低到14.03。经过优选的脱苦工艺处理后，苦肠中胆汁酸含量显著降低，口感上无明显苦味，对营养成分的破坏性小，可以被消费者接受，弥补了苦肠脱苦方法的空白。试验进行了苦肠碱法脱苦的研究，未能探索在脱苦过程中苦肠加工物性的变化，后续研究将探讨碱法处理对苦肠加工物性的影响。