曹留炳， 仲爱芳

(联勤保障部队第九O四医院常州医疗区检验病理科， 江苏 常州 213003)

胸腹水为进展期恶性肿瘤最为常见临床表现，胸腹水细胞检查由于具有损伤小、方法简单等优势，普遍应用于进展期恶性肿瘤临床诊断和治疗中[1]，而近年来随着分子生物学研究地日益广泛，分子生物学检测及临床靶向用药为肿瘤患者提供新的治疗方向，表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor ，EGFR)是一种有络氨酸激酶活性的重要跨膜受体，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖及分化等生理过程密切相关[2]。进展期肿瘤患者多已失去手术治疗时机，近年来EGFR的分子靶向用药逐渐应用于进展期恶性肿瘤患者治疗中，EGFR分子靶向药物进入体内会特异地选择致癌位点并与之相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，但研究表明仅有33.3%患者对EGFR为靶点的分子靶向药物敏感[3]。基于此背景，本文通过探讨EGFR基因在胸腹水细胞中的表达及临床意义，以期为肿瘤患者分子靶向用药提供参考，具体结果如下。

1 资料与方法

1.1一般资料：收集2018年6月至2019年6月本院存档的72例胸腹水细胞蜡块标本。①纳入标准：患者临床资料和病历资料完整；标本采集前未接受相关治疗。②排除标准：标本经镜下观察显示肿瘤细胞量<200个。72例患者，男45例、女27例，年龄22～70，平均(59.07±6.11)岁。其中恶性肿瘤53例(肺癌29例、乳腺癌12例、原发性肝癌8例、其他4例)、良性病变19例(细菌性肺炎11例、结核性胸膜炎5例、肝硬化3例)；恶性肿瘤患者，男性32例，女性21例，年龄22～69岁，平均(58.94±6.08)岁；良性病变患者，男性13例，女性6例，年龄23～70岁，平均(59.71±6.15)岁，恶性肿瘤、良性病变患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例患者均经组织病理检查确诊，随访结果显示恶性肿瘤经病理组织学检查EGFR基因突变2例。

1.2方法:主要仪器和试剂：EGFR鼠单克隆抗体由福州迈新生物技术开发公司提供，全自动免疫组化仪器由罗氏公司提供，显微镜由奥林巴斯公司提供；EGFR基因序列、qRT-PCR试剂盒由广州锐博生物科技有限公司，实时荧光定量PCR仪来源于美国ABI公司，RNA提取试剂盒源自凯杰公司，逆转录试剂盒由BIOMIGA公司提供。免疫组化：①样本处理，抽取的胸水样本轻微摇匀后分别放置在离心管(50mL)中，常规离心(2500r/min)5min后，其中一管送至细胞室涂片以初步评估细胞学病理情况。另一管丢弃上清液，随后吸取全部细胞层至干净的离心管中，以获得胸水细胞的悬液。常规离心(2500r/min)3min后，丢弃上清液，获取胸水细胞沉淀物，并检测EGFR基因突变情况。②胸腹水细胞蜡块标本处理，前3步与上述相同，在胸水沉淀物中加适量95%乙醇，混匀后室温静置35min，常规离心(3500r/min)离心3min，弃上清液，取出沉淀物置于无尘纸上，包好放置在包埋盒中，常规脱水-浸蜡包埋成蜡块-切片-免疫组化染色。③免疫组织化学染色结果判定：以细胞核出现棕黄色颗粒定义为阳性染色，同时半定量分析染色结果，在高倍镜下观察五个视野中的阳性细胞，阳性细胞不高于4%=0分，5%～24%=1分，25%～49%=2分，50%～74%=3分，≥75%=4分；根据染色强度评估：无色、淡黄、棕黄、棕褐色分别对应0分、1分、2分、3分；两项计分的乘积=0分视为阴性，1～2分为弱阳性，3～4分记为中等阳性，>4分记为强阳性，其中弱阳性、中等阳性和强阳性归为阳性。(3)EGFR基因表达量检测：采用Real-Time PCR法检测基因相对表达量，具体操作步骤：RNA提取-逆转录合成cRNA-引物设计-三步法扩增-结果分析[以管家基因β-Actin为内参照基因，每个样本测3次取平均Ct值(相差0.5个Ct值则舍弃)，相对定量采用2-ΔΔCt法，其中ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt]。(4)EGFR基因位点检测：应用突变扩增阻滞系统法和EGFR基因突变检测试剂盒(实时荧光PCR法)，按照试剂盒说明书提取DNA后采用突变扩增阻滞系统法检测EGFR基因突变情况，每批次实验均选用阳性对照和阴性对照。

1.3观察指标：①胸腹水细胞蜡块中EGFR基因的免疫组化染色情况分析。②胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达情况分析。③胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果分析，其中EGFR基因无突变为野生型，而存在任意类型的突变为突变型。④恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果与组织病理结果对照分析。

2 结 果

2.1胸腹水细胞蜡块中EGFR基因的免疫组化染色情况分析：免疫组化结果显示EGFR基因在良性胸腹水细胞中呈阴性、弱阳性表达，而恶性胸腹水细胞中呈不同强度阳性表达，并且恶性病变胸腹水细胞的EGFR阳性表达率明显高于良性病变胸腹水细胞(P<0.05)，见表1和图1。

表1 胸腹水细胞蜡块中EGFR基因的免疫组化染色情况分析

图1 a：肺癌胸腹水细胞石蜡块免疫组化染色(×100)；b：肝硬化胸腹水细胞石蜡块免疫组化染色(×100)

图1a提示恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因呈阳性表达，如图中箭头所示(染色强度为棕褐色，且阳性细胞占比高)；而图1b提示良性病变胸腹水细胞中EGFR基因呈阴性表达，如图中箭头所示(染色强度为淡黄色，但不高于4%)。

表2 胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量分析

2.2胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量分析：恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量较良性病变胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量显著高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果分析：53例恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变1例，其中EGFR基因第19外显子被证实存在缺失突变(E746-A750 DEL)；而EGFR基因第18，20，21外显子未发现突变和SNP位点。

2.4恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果与组织病理结果对照分析：恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果与组织病理结果的一致性较好，Kappa值=0.658，检测的准确率为98.08%，见表3。

表3 恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果与组织病理结果对照分析(n)

3 讨 论

EGFR抑制剂靶向用药是进展期肿瘤患者有效治疗手段，但临床实践发现在EGFR抑制剂应用后不可避免地出现耐药情况，主要原因与EGFR基因突变所致耐药突变有关，为提高进展期肿瘤患者的靶向用药有效性，进一步积极探寻动态监测基因突变的方法至为重要[4]。胸腹水细胞检查是病理学诊断的重要手段之一，然而常规胸腹水涂片上所富集的肿瘤细胞量少，较难精确地提供组织学来源，无法适用于免疫组化的鉴别诊断，目前随着胸腹水细胞蜡块技术逐渐应用于病理学鉴别诊断中，胸腹水细胞蜡块不仅可多次取材且可富集肿瘤细胞。HE细胞不存在皱缩及变性，明显提高了细胞病理学诊断的准确性，与手术标本及穿刺标本在病理诊断和基因检测等方面相比较，胸腹水细胞蜡块检查有创伤小、实时检测耐药基因或探寻其他药物敏感基因等明显的优势[5]。

研究表明无法获取组织活检的晚期非小细胞肺癌患者，胸腹水细胞蜡块技术检测患者EGFR基因突变状态较血液标本更具优势，且可取代组织学标本检测，另一项研究报告则指出外周血ctDNA中EGFR基因突变型患者的客观缓解率和疾病控制率明显高于野生型患者，且中位无进展生存时间较野生型患者的长[6]。本结果显示EGFR基因在良性胸腹水细胞石蜡块标本中呈阴性、弱阳性表达，恶性胸腹水细胞石蜡块标本中呈不同强度的阳性表达，恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量较良性病变胸腹水细胞中EGFR基因的相对表达量显著高，初步表明EGFR基因在进展期恶性肿瘤中呈明显上调趋势。EGFR属于一种抑制细胞凋亡的跨膜蛋白，研究表明其在调节肿瘤细胞生长、增殖及分化中起着重要作用，故而推测EGFR基因或参与肿瘤发生发展[7]。

早期文献报道非小细胞肺癌患者中检测EGFR基因的突变状态是决定患者是否采用EGFR-络氨酸激酶抑制剂治疗的首要条件[8]。另一项研究则指出EGFR-络氨酸激酶抑制剂可明显延长EGFR基因突变阳性非小细胞肺癌患者的总生存期和无病生存期[9]。基因19外显子缺失突变和21外显子L85 8 R位点的突变可提高其结合抑制剂的能力。而本结果显示53例恶性病变胸腹水细胞石蜡块中EGFR基因突变1例，其中EGFR基因第19外显子被证实存在缺失突变，突变位点为E746-A750 DEL，而EGFR基因第18，20，21外显子未发现突变和SNP位点，与上述研究证实的21外显子L85 8 R位点的突变增加药物敏感性的观点存在一定差异，提示EGFR基因突变位点为E746-A750 DEL可能对EGFR-络氨酸激酶抑制剂类药物敏感，对于存在E746-A750 DEL位点基因突变的肿瘤患者可推荐应用EGFR-络氨酸激酶抑制剂类药，利于患者病情的有效控制，同时临床过程中需动态监测肿瘤患者EGFR基因突变情况以及时掌握用药情况。此外，本结果还证实了恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变检测结果与组织病理结果的一致性较好，说明恶性病变胸腹水细胞中EGFR基因突变的检测可作为肿瘤患者个体化治疗方案的制定提供参考。

综上所述，EGFR基因在胸腹水细胞中的表达呈明显上调趋势，且胸腹水细胞中可用于恶性肿瘤患者驱动基因检测的有效依据，EGFR基因在胸腹水细胞中的检测有助于临床筛选靶向用药适用患者，有望为患者制定个体化治疗方案提供参考。