孟祥慧 初金玉 王九妹 马志红 马红艳

【摘要】恶性黑色素瘤（Malignant Melanoma，MM）是由突变的黑色素细胞大量增殖而引起的一种恶性肿瘤。而其发病率约占到人体全身恶性肿瘤的 4%～5%。近几年调查结果发现，恶黑正以每年 3%～5%的速度在逐年递增，不容小觑。临床上可通过各种途径来诊治恶性黑色素瘤，但目前最有效的方法还是早期诊断以及早期手术扩大切除、淋巴结清扫。然而，相当一部分黑色素瘤患者仍发生了癌细胞转移，预后不良，五年生存率约为 20%。到目前为止，导致黑色素瘤发生的确切的分子机制，尤其是分子转移机制在很大程度上仍然是未知的。肿瘤的免疫调控和免疫治疗是近年来医学领域的研究热点，但学者们对MM 的免疫机制研究仍较少涉及。有研究发现，在恶黑中和周边往往存在淋巴细胞，而Th17 细胞及其特异性分泌的细胞因子IL-17 在MM 中发挥极其重要的作用。 IL-17 是一种重要的炎症介质， 与炎症、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫病等多种疾病的发生发展密切相关。其中γδ T 细胞作为免疫反应早期IL-17 的最重要来源，因其在多种感染性疾病和自身免疫性疾病中发挥重要作用而备受关注。本实验将研究γδT17 细胞的聚集是否由于MM中促炎因子刺激分化和趋化因子诱导募集的结果。目的：探讨MM 患者肿瘤、瘤旁和外周血γδT17 细胞与其他特异性T细胞亚型的相互作用，明确γδT17 细胞与患者预后及化疗疗效的相关性.方法：采用免疫组化和流式细胞技术检测肿瘤组织、瘤旁组织γδT17细胞数量，并探讨分泌IL-17 的T细胞之间的相关性结果：免疫组化结果显示肿瘤组织中的γδT17 细胞数量均明显高于瘤旁组织，流式细胞检测结果显示证实γδT17细胞内 CCL25 在恶黑组织中高表达。结论：恶黑肿瘤组织中的 γδT17 细胞迁移和富集可能是由 CCL25 介导的，在恶性黑色素瘤的发病中发挥重要作用

【关键词】 恶黑;γδT17细胞;CCL25;趋化因子

黑龙江省省属高等学校基本科研业务费科研项目 （2018-kyywfmy-0073）

1、材料和方法

1.1 收集临床材料和标本 收集于2018年1月至2021年1月在我院行手术治疗的30例皮肤恶性黑色素瘤患者;年龄41-68岁。同期就诊我院的30例色素痣患者为对照组，年龄35-65岁，本研究经医学伦理委员会审核批准。手术过程中收集癌组织和癌旁组织，用于石蜡组织包埋和提取单个核细胞用于免疫组织化学 流式细胞检测。所需要的抗体均购于eB公司。

1.2流式细胞检测 收集用于检测的组织、外周血，分别经 ficoll 和 percoll

密度梯度离心富集淋巴细胞后，先染 viability dye 以排除死细胞，接著孵育细胞表面marker anti-CD4 和 anti-CD3 抗体，接着用 PMA（0.25?g/ml）、Ionomycin（0.25?g/ml）和 Golgi Stop 液处理细胞，然后固定破膜后加入抗体对 γδT17细胞和CCL25 进行染色。用 FACS Fortessa 流式仪进行上机检测，收集实验数据用lowJo 软件进行分析γδT17细胞和CCL25的变化

1.3免疫组织化学 将包埋好的组织连续切成4μm 的切片，经过烤片、脱蜡、抗原修复、过氧化物酶灭活、加入一抗4摄氏度冰箱过夜、二抗37°孵育30分钟、DAB显色，苏木素反蓝、脱水、封片。以胞核中出现棕黄色或棕褐色着色为阳性表达，进行计数，统计。

1.4 统计学方法

数据采用 SPSS 21.0 统计软件进行统计分析，计数资料用 x ±s 表示，采用 t检验，计量资料用例（%）表示，采用 χ2检验，相关分析采用 Spearman 秩相关检验。无进展生存时间计算采用 Kaplan-Meier 法和 Log-rank 检验，组间临床资料的均衡性采用 χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 γδT17细胞在恶黑细胞中的表达情况

在本组恶性黑色素瘤肿瘤组织中，γδT17细胞的阳性表达达90%以上，而在瘤旁组织中的表达相对较低占45%，在正常组织中表达不明显。

2.2恶性黑色素细胞肿瘤组织中瘤旁组织中趋化因子CCL25水平

3 讨论

恶性黑色素瘤发病率约占到人体恶性肿瘤的 4%—5%。调查发现，恶黑正以每年3%左右的速度在逐年递增，因此对其潜在的发病机制研究和寻求 新的治疗手段显得尤为迫切。 肿瘤的免疫调控和免疫治疗是近年来医学领域的研究热点，有研究表明，在多种恶性肿瘤和肿瘤转移中往往存在淋巴细胞，而γδT17细胞及其特异性分泌的细胞因子 IL-17 在肿瘤发生和转移中发挥极其重要的作用。

IL-17 是一种重要的炎症介质， 与炎症、肿瘤、过敏性疾病、自身免疫病等多种疾病的发生发展密切相关。早期的研究显示活化的Th17 细胞主要通过分泌 IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-22、IL-21 等细胞因子发挥作用，并被认为是 IL-17 的主要来源[4]。然而 Th17细胞的作用机制并不能解释在一些应激反应及宿主免疫早期起重要作用的 IL-17 的产生。事实上，γδT 细胞、NK 细胞、嗜中性粒细胞等多种固有免疫细胞均可产生 IL-17。这些细胞多分布于隔开宿主和外界环境的皮肤和粘膜组织，并在免疫系统中扮演哨兵的角色。其中γδ T 细胞作为免疫反应早期 IL-17 的最重要来源，因其在多种感染性疾病和自身免疫性疾病中发挥重要作用而备受关注[5]。

CCL25 为主要表达于胸腺和小肠上皮的趋化因子，其受体 CCR9 可以调节 CCR9 阳性细胞的趋化运动。近来研究表明，CCL25/CCR9 在多种肿瘤的生长、浸润、转移发挥作用。本实验中我们发现在恶性黑色素瘤组织中存在CCL25和γδ TH17细胞的高表达，然后通过PI3K/AKT 途径调控恶性细胞的凋亡。综上所述，我们提出假说，所以我们认为，CCL25 可能诱导 γδT17 细胞向肿瘤组织迁移，该作用可能通过 CCL25/CCR9- BTLA- STAT5 信号途径实现。

參考文献

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[4].Zú?iga LA， Jain R， Haines C， Cua DJ. Th17 cell development： from the cradle to the grave. Immunol Rev：2013，252（1）：78-88.

[5].He D， Li H， Yusuf N， Elmets CA， Li J， Mountz JD， Xu H.IL-17 promotes tumor development through the induction of tumor promoting icroenvironments at tumor sites and myeloid- derived suppressor cells. J Immunol： 2010，184（5）： 2281-2288.

[6].Li B，Wang Z， Zhong Y， Lan J， Li X， Lin H.CCR9-CCL25 interaction suppresses apoptosis of lung cancer cells by activating the PI3K/Akt pathway.Med Oncol：2015，32（3）：66.