万 顺 杜方明 米 军

兰州大学第二医院泌尿外科（甘肃兰州730000）

一、前言

前列腺癌（Prostatic Cancer，PCa）是全球男性癌症死因的第二大因素，据2018年的流行病学统计，全球有近128万新发病例和35.9万死亡病例[1]。PCa分为惰性PCa和侵袭性PCa，惰性前列腺癌通常指Gleason评分≤6分、分期T2a、癌灶总体积≤0.5ml，侵袭性前列腺癌通常指Gleason评分＞7分、癌灶总体积＞0.5ml或穿刺肿瘤直径＞6mm。侵袭性PCa通常会在局部浸润或向远处转移至其他器官，从而导致较高的死亡率[2]。侵袭性PCa高死亡率的原因之一是当前的诊断方法存在不足，一直以来，侵袭性PCa的诊断金标准是基于血清前列腺特异性抗原（Prostate Specific Antigen,PSA）水平而进行的超声引导下经直肠前列腺穿刺活检[3]；但是这种方法具有侵入性，并且基于PSA的阈值作为穿刺活检的标准，会导致大量不必要的活检及漏诊。所以当前发展高特异性、高灵敏度的无创检测方法是一种趋势。外泌体是一类由细胞分泌的膜性囊泡小体，广泛存在于多种体液环境中，它是一种包含脂质、蛋白质、核酸的生物载体，可以在人体的血液、精液、尿液中检测到[4]，到目前为止外泌体在诊断消化系统恶性肿瘤、神经系统疾病、泌尿生殖道恶性肿瘤以及其他恶性肿瘤中的作用已经得到广大科研人员的重视[5]。外泌体在PCa检测中的高灵敏度及准确度也已经得到肯定。当前PCa临床管理中的主要挑战是无法通过传统的诊断方法准确地区分惰性PCa和侵袭性PCa，而外泌体能够准确地检测及识别侵袭性PCa进而及时地治疗，这不仅能够有效地延缓PCa的进展，更能延长患者的生命。

二、外泌体miRNA

（一）外泌体MiR-1246

MiR-1246是一种小的非编码RNA，通过与同源mRNA靶标的3'非翻译区（Untranslated Region,UTR）进行序列特异性相互作用来调节转录后的基因表达[6]，它是一种大量存在于外泌体中的稳定生物标记物，可以从人体血液中提取而来。在Bhagirath D等人[7]研究中，他们筛选出正常人组、良性前列腺增生（Benign Prostate Hyperplasia,BPH）组、惰性PCa组和侵袭性PCa组血液中的外泌体miRNA，比较发现有三种显著上调的miRNA（miR-1246，miR-302c-3p，miR-509-5p）。其中外泌体miR-1246在侵袭性PCa中的表达相较于正常组上调了约31倍，相较于BPH组上调了约23倍。在侵袭性PCa中外泌体miR-1246特异性上调，而另外一个被观察到的有趣的结果显示：外泌体miR-1246的水平随着PCa病理分期的增加而增加。除此之外，淋巴结转移与该外泌体中的miRNA高表达有很强的相关性，由此我们可以联想该miRNA可能预测肿瘤侵袭程度/局部转移。也有研究表示MiR-1246可以作为侵袭性PCa的潜在新型生物标志物，不仅可用于疾病诊断，也可预测疾病阶段[8]。

（二）外泌体miR-888

miRNA是一类在PCa中表现出广泛失调的小型非编码RNA，而miR-888是在人类侵袭性细胞中差异最显著的miRNA。一项研究显示不仅可以从血液中检测到外泌体miR-888，从人体前列腺液中也是可以检测到外泌体miR-888[9，10]。miR-888与PCa的进展有关，并且miR-888的水平与侵袭性PCa的侵袭程度呈正相关[9]。Lewis H等人[10]通过收集前列腺分泌物后筛选出与侵袭性PCa相关的miRNA，在侵袭性前列腺癌细胞与惰性前列腺癌细胞中分析外泌体miR-888簇的含量及表达水平，通过比较发现在侵袭性PCa细胞中富含外泌体miR-888。也有研究证实了外泌体中的miR-888诱导人PCa细胞的增殖、迁移和集落形成[9]。因此，从前列腺分泌物中筛查外泌体miR-888可以帮助临床医生更准确地对PCa患者进行危险分层，这不仅可能避免惰性PCa的过度诊断及治疗，更能针对侵袭性PCa进行多模式个性化治疗。

（三）外泌体miR-2909

miR-2909是一种雄激素诱导的miRNA，可通过减弱TGF-β信号传导的肿瘤抑制作用发挥其致癌作用[11]，它可以从人体尿液外泌体中分离出来，并且其募集程度与PCa的分期呈正相关。Wani S等人[12]将PCa受试者分低风险(Low Risk,LR)、中等风险(Intermediate Risk,IR)和高风险(High Risk,HR)组；然后分别从LR、IR和HR组中分离出外泌体中的miRNA，通过分析发现HR组中外泌体miR-2909的募集程度显著高于LR及IR组，并且尿外泌体中miR-2909募集程度与Gleason评分显示的PCa严重程度呈正相关[12]。由此可见，尿液外泌体中miR-2909具有成为检测侵袭性PCa的非侵入性生物标志物的潜力。

综上，为了避免惰性PCa的过度治疗，将外泌体作为无创性检测侵袭性PCa的诊断方法是最好的选择，而创建一种外泌体评分能够很好地将PCa分为低危、中危、高危类别。Mihelich BL等人[13]为了评估术前血清外泌体中miRNA的诊断和预后价值，分析了50例BPH男性和100例PCa男性，PCa患者中包含50例确诊为惰性PCa患者和50例确诊为侵袭性PCa患者。在侵袭性PCa里发现14种外泌体中miRNA的表达水平相较于惰性PCa与BPH低，将这14种外泌体中miRNA表达水平通过统计学换算成外泌体miR评分，于是产生了两个miR分数；其中miR score1是外泌体miRNA在PCa患者中的平均表达水平对应乘上测量的外泌体miRNA水平之后的和，而miR score2则是外泌体miRNA分别在BPH与PCa患者中的平均表达水平对应乘上测量的BPH与PCa患者的外泌体miRNA水平之后的和，具体计算如下：

假设在50例BPH与50例PCa患者尿液或血液中检测到7种外泌体miRNA（miR1至miR7）。

分别计算出miR1至miR7在50例PCa患者中的平均值，分别记为X1至X7。

分别计算出miR1至miR7在50例BPH患者中的平均值，分别记为Y1至Y7。

则miR score1=（X1 x实测值miR1）+（X2 x实测值miR2）+…+（X7 x实测值miR7）

miR score2=（Y1 x实测值miR1）+（Y2 x实测值miR2）+…+（Y7 x实测值miR7）

7.19可以作为miR score1的阈值，当大于7.19时可认为该患者为侵袭性PCa，小于7.19时则认为该患者为惰性PCa。

7.85可以作为miR score2的阈值，当大于7.85时可认为该患者为BPH或惰性PCa，小于7.85时则认为该患者为侵袭性PCa。

（文档中相关数据从Mihelich BL等人[13]的研究中提取）

miR评分越高显示疾病的侵袭程度越强，经过优化的miR score1可以将惰性PCa患者与侵袭性PCa患者区分开，而miR score2可以将BPH、低级PCa与侵袭性PCa患者区分开来[13]。该miRNA评分对侵袭性PCa患者有实用价值。Gleason评分反映了PCa的分化程度，并与PCa的侵袭性程度有关；因此可以将Gleason评分及外泌体miRNA评分相结合应用，以更好地区分出惰性PCa及侵袭性PCa。

三、外泌体PCA3和PRAC

PCa抗原基因3（Prostate Cancer Antigen Gene 3，PCA3）是一种长的非编码RNA，仅在PCa组织中表达，而与血清PSA水平及前列腺体积、大小无关[14]。PCa易感性候选物 （Prostate Cancer Susceptibility Candidate,PRAC）是编码382个核苷酸RNA的新基因，有研究显示它在侵袭性PCa中表达下调，证明了它与侵袭性PCa相关[15]。最近有研究人员从尿液里分离出了外泌体PCA3和PRAC，这是预测易感人群的一种非侵入性检测方法[16]。Ye L F等人[16]对收集的89名初次或者重复前列腺活检穿刺患者的尿液样本里分离出的外泌体中的PCA3和PRAC进行分析，结果表明外泌体中PCA3的表达在侵袭性PCa中增加更为明显，而惰性PCa组的外泌体中PRAC表达显著降低。将PCA3和PRAC的表达水平结合用以转换成LBXexo分数评分，LBXexo评分定义为相对于PRAC表达的对数转换PCA3的表达水平，具体计算如下：

假设在PCa患者尿液样本中测得外泌体PRAC与外泌体PCA3值分别为PRAC与PCA3。

则LBXexo评分=Log（PRAC）PCA3

LBXexo评分值越大表明其侵袭性越强，当LBXexo评分值大等于5时，可百分百预测PCa等级。

（文档中相关数据从Ye LF等人[16]的研究中提取）

在PSA水平低于20ng/ml的活检阳性的侵袭性PCa中，LBXexo评分对PCa侵袭程度判定优于单独的外泌体PCA3/PRAC，并且LBXexo评分测试可以对前列腺癌危险分层[16]。综上，外泌体中PCA3和PRAC不仅可以单独预测侵袭性PCa，其结合产物LBXexo评分更能准确地诊断及预测包括任何等级的PCa。

四、外泌体中的Myosin IC和同工型A

Myosin IC被认为是一种非传统型单头非肌肉肌球蛋白，而分子Myosin IC的罕见同工型A的表达水平可以区分PCa的侵袭程度，并且该外泌体能够从血液与尿液中检测到[17]。Maly I V等人[17]通过培养侵袭性PCa细胞系PC3分泌的外泌体，从中发现了Myosin IC和同工型A，并且惊奇地发现Myosin IC的同工型A促进了前列腺上皮细胞分泌外泌体，进而增强其侵入细胞外基底膜的能力。该基底膜的破坏标志着脂质体的转化，并且体内细胞对基底膜的破坏能力与PCa的转移有关。外泌体中的Myosin IC和同工型A不仅对前列腺上皮细胞侵袭能力有直接影响，而且该分子的分泌功能还可能通过外泌体介导的肿瘤细胞重塑基质的刺激而对肿瘤侵袭产生二次促进作用；也有研究证明了这种外泌体同工型A在侵袭性PCa中特异性表达[18]。综上说明外泌体中的Myosin IC和同工型A可以作为检测侵袭性PCa的无创检查的标志物。

五、总结与展望

外泌体具有稳定性、生物相容性、通透性、低毒性和低免疫原性的生物物理特性[19]，并且外泌体在肿瘤细胞的侵袭、迁移和转化过程中发挥着重要的作用[20]，正是因为外泌体的这些特点，让其能够成为诊断侵袭性PCa的天然生物标志物。相比于前列腺穿刺活检，外泌体不仅更准确、更灵敏，而且其无创的特点对临床医生及患者都有重要的意义[21]。但是目前用外泌体诊断侵袭性PCa仍处于起步阶段，我们依然有许多问题需要解决，如：①目前关于外泌体检测侵袭性PCa的研究较少，需要更多的临床研究及循证医学来认证。②目前对外泌体在临床中用途的研究仍然不够全面，需要进一步的研究来建立外泌体的表征及操作标准。③外泌体的分离、提纯一直是个难点，如何确定合适的剂量以获得高度纯化的外泌体也需要广大研究人员攻克，而外泌体中各种物质的组成和作用机理也仍然需要更深的探究。简而言之，外泌体是用于检测侵袭性PCa的非常有前途的工具，但其首先需要解决仍然存在的许多挑战性问题。