刘路阳 杜少华 王 闪 董新新 高 鑫

（河南科技大学附属许昌市中心医院口腔科，许昌 461000）

头颈部鳞状细胞癌是全球第六大最常见的恶性肿瘤， 病死率约为50%，每年影响60 万新患者，而口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）占所有头颈部鳞状细胞癌病例的绝大多数[1]。口腔鳞状细胞癌的治疗方式包括外科手术和放射疗法，局部复发率仍较高[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是长度为19 至24 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，可作为癌基因或抑癌基因调控癌细胞的增殖、侵袭、凋亡及血管生成情况[3]。最近研究表明，与正常细胞相比，miRNA 在口腔鳞状细胞癌和口腔鳞状细胞癌衍生细胞系中的表达失调，表明它们在口腔癌发展中的潜在作用[4]。已有研究表明miR-98-5p 可抑制喉鳞癌Hep-2 细胞的增殖，可作为肿瘤抑制剂参与口腔鳞状细胞癌肿瘤进展的调节[5-6]。但目前还没有关于miR-98-5p对口腔鳞状细胞癌的具体作用机制的研究，故本研究旨在探讨miR-98-5p 对人舌鳞癌细胞SCC-25 凋亡和肿瘤干样特性及裸鼠成瘤的影响。

1 材料和方法

1.1 实验试剂

Dulbecco's modified Eagle's medium 培养基 （12100-046）、青-链 霉素（15140-122）、胎牛血清（26400-036）、胰蛋白酶（15050-057）和F12培养基（21700-075）购自美国Gibco公司；LipoRNAi™转染试剂（C0535）、二辛可宁酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒（P0012）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（C1062S）购自上海碧云天生物技术研究所；Anti Ki67（ab15580）、增殖细胞核抗原（PCNA）（ab18197）、Bax（ab53154）、Bcl-2（ab196495）、信号转导和转录活化因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）（ab5073）购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养

人舌鳞癌细胞SCC-25 来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，将细胞培养于DMEM培养基中，添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素，置于37℃含5%CO2的培养箱中培养，每24 h更换新鲜培养基，1∶2 传代。选用对数生长期细胞为实验用细胞。

1.3 细胞处理与分组

取对数生长期的SCC-25 细胞1.5×105个接种于6 孔板，细胞密度达60%时，按LipoRNAi™转染试剂说明书的方法将mimic mock、miR-98-5p mimic、inhibitor-NC、miR-98-5p inhibitor 转 染 至SCC-25 细胞，细胞分为control 组、mimic-mock 组、mimic组、inhibitor-NC组和inhibitor组。Control组为空白对照，仅加转染试剂；mimic-mock组转染mimic mock，即miR-98-5p mimic随机打乱后的无意义的基因序列；mimic组转染等量的miR-98-5p mimic; inhibitor-NC组 转 染inhibitor NC；inhibitor组转染miR-98-5p inhibitor；每组设5个复孔。

1.4 RT-PCR

用TRIzol 法从SCC-25 细胞中提取总RNA，用Nanodrop 分光光度计测定吸光度（A260/A280），按照试剂盒说明书进行cDNA 的合成和PCR 的扩增，反应条件为：94℃预变性5 min; 94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸30 s，扩增35 个循环; 72℃延长10 min;存储在4℃条件下。反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离。miR-98-5p 正义链为：5'-GGAAAATCGCCATAGCCAGG-3'，反义链为：5'-AGATCAGGGTGGCCCCATTT-3'；Ki67 正义链为：5'-GTGAGGGAATACCTTTGA-3'，反义链为：5'-CCTGATGGTTGAGGCTGT-3'；PCNA 正 义 链为：5'-TCAAGAAGGTGTTGGAGGCA-3'，反义链为：5'-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3'；Bax 正义链为：5'-TGGCAGCTGACATGTTTTCTGAC-3'，反义链为：5'-TCACCCAACCACCCTGGTCTT-3'；Bcl-2 正义链为：5'-TCGCCCTGTGGATGACT GA-3'，反义链为：5'-CAGAGACAGCCAGGAGAAATC A-3'；GAPDH 正义链为：5'-CGCTGAGTACGTC GTGGAGTC-3'，反义链为：5'-GCTGAT-GATCTT GAGGCTGTTGTC-3'；以GAPDH 为内参，用2-ΔΔCT方法进行定量计算。

1.5 克隆形成法

在培养皿中培养细胞至约30%融合度，继续培养4 d，吹散为单个细胞，用6 孔板培养，约5×102个细胞/孔，培养14 d，弃掉培养基，用4%多聚甲醛固定30 min，后用0.5%结晶紫染色15 min，用去离子水漂洗晾干，进行拍照观察。＞50个细胞的集落计为1 个克隆。克隆形成率=形成克隆细胞数目/接种细胞数目×100%。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

收集悬浮细胞至10 mL 的离心管中，每样本细胞数为3×106/mL，500 ～1 000 r/min 离心5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1 次，500 ～ 1 000 r/min 离 心5 min，用100 μL 的 标 记 溶 液 重悬细胞，室温下避光孵育10 ～15 min，500 ～ 1 000 r/min 离心5 min，沉淀细胞孵育缓冲液洗 1 次，加入荧光（SA-FLOUS）溶液，4℃下孵育20 min，避光并不时振动，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 细胞成球实验

将各组细胞经流式细胞仪计数后铺至超低黏附96 孔板。每孔100 μL F12 成球培养基，含10 个活细胞，各铺10 个复孔。静置培养14 d 后倒置显微镜下观察成球率及成球体积。成球率=每孔细胞球数目总和/每孔加入的细胞数×100%。

1.8 裸鼠移植瘤模型

10 只Balb/c 裸鼠购自北京维通利华动物科技有限公司，雄性，5 周龄，体质量（20±2）g，许可证号：SCXK（京）2015-0001，在特定的无病原体条件下饲养。将1×106/mL 的control 组和mimic 组SCC-25 细胞悬液100 μL 分别通过皮下注射植入BALB/c 裸鼠腋窝皮下[7]，7 d 内异种移植瘤出现，表示模型建立成功。

1.9 肿瘤体积及质量

模型建立后从第3 天起每隔3 d 记录所成瘤的长径和短径，体积=长径×短径2×1/2。在第30 天记录下移植瘤的长径和短径后，断颈法处死裸鼠，对肿瘤称重。

1.10 免疫组织化学检测Ki67 表达

取各组肿瘤组织，常规石蜡包埋制成厚度约4 μm 的切片，按免疫组织化学检测试剂盒说明书进行免疫组织化学显色，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒显色，苏木精复染，盐酸乙醇分色，光学显微镜观察Ki67在肿瘤组织中的表达情况。

1.11 免疫印迹检测p-STAT3/STAT3 水平

收集各组细胞或肿瘤组织（100 mg），在冰上溶解25 min。以12 000 r/min 离心10 min，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，用BCA 试剂盒测定蛋白质含量。提取等量的蛋白质样品（20 mg），在100℃条件下变性5 min。然后使用SDS-PAGE 凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4℃条件下加入相应一抗（1：1 000）并孵育过夜，清洗，然后在4℃下加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入发光液，曝光处理。Image J 软件统计灰度值。

1.12 统计学处理

本研究所有对比数据用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学分析。数据表示为±s，各组间进行比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-98-5p 表达水平

SCC-25细胞转染miR-98-5p mimic/miR-98-5p inhibitor 后通过RT-PCR 检测miR-98-5p 表达水平，结果显示（图1）， 与control 组相比较，mimic mock 组和inhibitor-NC 组miR-98-5p 水平差异无统计学意义（P＞0.05），mimic 组miR-98-5p 水平显著升高（P＜0.05），inhibitor 组miR-98-5p 水平显著降低（P＜0.05）。

图1 SCC-25 细胞转染miR-98-5p mimic（A） 和inhibitor 后miR-98-5p（B）表达水平Fig 1 Expression level of miR-98-5p after transfection of SCC-25 cells with miR-98-5p mimic （A）and inhibitor（B）

2.2 miR-98-5p 对SCC-25 细胞增殖的影响

通过克隆形成法检测各组细胞增殖，结果显示（图2）， 与control组相比较，mimic-mock组和inhibitor-NC 组克隆形成率差异无统计学意义（P＞0.05），mimic组克隆形成率显著降低（P＜0.05），inhibitor 组克隆形成率显著升高（P＜0.05）。通过RT-PCR 检测各组细胞Ki67、PCNA mRNA水平， 结果与control 组相比较，mimic mock组和inhibitor-NC组Ki67、PCNA mRNA水平差异无统计学意义（P＞0.05），mimic组Ki67、PCNA mRNA水平显著降低（P＜0.05），inhibitor组Ki67、PCNA mRNA 水平显著升高（P＜0.05） （表1）。

2.3 miR-98-5p 对SCC-25 细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡，结果显示（图3），与control 组相比较，mimic-mock组和inhibitor-NC 组细胞凋亡率差异无统计学意 义（P＞0.05），mimic组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），inhibitor 组细胞凋亡 率显著降低（P＜0.05）。通过RT-PCR检测各组细胞Bax、Bcl-2 mRNA水平，结果与control组相比较，mimic mock组和inhibitor-NC组Bax/Bcl-2比值差异无统计学意义（P＞0.05），mimic组Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.05），inhibitor组Bax/Bcl-2比值降低（P＜0.05）（表1）。

图2 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞克隆形成率的影响Fig 2 Effect of transfection of miR-98-5p on the clonal formation rate of SCC-25 cells

图3 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞凋亡的影响Fig 3 Effect of transfection miR-98-5p on apoptosis rate of SCC-25 cells

2.4 miR-98-5p 对SCC-25 细胞成球体积和成球数目的影响

检测各组细胞成球体积、成球数目，结果显示与control 组相比较，mimic mock 组和inhibitor-NC 组成球体积、成球数目差异无统计学意义（P＞0.05），mimic 组成球体积、成球数目显著降低（P＜0.05），inhibitor 组成球体积、成球数目显著升高（P＜0.05）（表2）。

2.5 miR-98-5p 对SCC-25 细 胞p-STAT3/STAT3 水 平的影响

通过免疫印迹检测各组细胞STAT3 磷酸化情况，结果显示：与control 组相比较，mimic mock组 和inhibitor-NC 组p-STAT3/STAT3 水 平 差 异 无统计学意义（P＞0.05），mimic 组p-STAT3/STAT3水 平 显 著 降 低（P＜0.05），inhibitor 组p-STAT3/STAT3 水平显著升高（P＜0.05）（图4）。

表1 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞Ki67、PCNA、 Bax/Bcl-2 mRNA 水平的影响（±s）Tab1 Effects of miR-98-5p transfection on mRNA levels of Ki67， PCNA and Bax/Bcl-2 in SCC-25 cells（±s）

表1 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞Ki67、PCNA、 Bax/Bcl-2 mRNA 水平的影响（±s）Tab1 Effects of miR-98-5p transfection on mRNA levels of Ki67， PCNA and Bax/Bcl-2 in SCC-25 cells（±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Ki67 mRNA PCNA mRNA Bax/Bcl-2 Control group 1 1 1 Mimic-mock group 0.99±0.06 1.02±9.57 0.98±0.03 Mimic group 0.13±21.73* 0.17±14.03* 3.98±0.55*Inhibitor-NC group 0.98±9.41△ 0.99±7.68△ 0.97±0.06 Inhibitor group 2.24±0.26* 1.88±0.29* 0.37±0.06*

表2 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞成球体积 和成球数目的影响（±s）Tab 2 Effects of transfection of miR-98-5p on the volume and number of pellet formation of SCC-25 cells（±s）

表2 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞成球体积 和成球数目的影响（±s）Tab 2 Effects of transfection of miR-98-5p on the volume and number of pellet formation of SCC-25 cells（±s）

*P＜0.05 vs control group

Group Ball volume （μm3） Ball number/100 cells Control group 48.66±5.06 42.09±6.52 Mimic-mock group 52.47±6.85 44.15±4.07 Mimic group 13.58±3.93* 9.84±2.13*Inhibitor-NC group 55.28±7.62 45.26±6.66 Inhibitor group 148.29±21.04* 82.13±9.33*

2.6 miR-98-5p 调控移植瘤裸鼠模型生长

检测移植瘤裸鼠模型肿瘤质量结果如图5A、5B 所示，与control 组相比较，mimic 组肿瘤质量显著降低（P＜0.05）；检测移植瘤裸鼠模型肿瘤体积结果如图5C 所示，与control 组相比较，mimic组肿瘤体积显著降低（P＜0.05）；免疫组织化学检测Ki67 表达结果如图5E 所示，与control 组相比较，mimic 组Ki67 阳性表达率显著降低（P＜0.05）；免疫印迹检测各组细胞STAT3 磷酸化情况结果如图5F 所示，与control 组相比较，mimic 组p-STAT3/STAT3 水平显著降低（P＜0.05）。

图4 转染miR-98-5p 对SCC-25 细胞p-STAT3/STAT3 水平的影响Fig 4 Effects of miR-98-5p transfection on p-STAT3 /STAT3 levels in SCC-25 cells

图5 miR-98-5p 对移植瘤裸鼠模型的影响Fig 5 Effect of miR-98-5p on transplanted tumor nude mouse model

3 讨论

口腔鳞状细胞癌具有高发病率和死亡率，严重影响患者的生活质量。目前口腔鳞状细胞癌的治疗多以外科手术为主，但因其易向颈部淋巴结转移，且侵袭力较强，5 年生存率约60%[8]。近年来，已经探索了许多新颖的生物标记物有效用于口腔鳞状细胞癌临床应用，其中包括microRNA。本研究通过转染miR-98-5p，研究miR-98-5p 表达上调或下调对SCC-25 细胞的影响。

细胞增殖率的改变是肿瘤进展的标志之一，因此，评估这一特征可能有助于预测患者的预后[9]。PCNA 是一种核蛋白，是细胞增殖的标志，可精确反映细胞增殖和DNA 合成的速率。Ki67 是增殖细胞核相关抗原，相关研究表明，表达较高Ki67 的肿瘤预后较差，与肿瘤大小、血管浸润和恶性肿瘤的其他生物学行为密切相关[10]。本研究结果显示，miR-98-5p 表达升高具有降低SCC-25 细胞克隆形成率和Ki67、PCNA mRNA 水平及裸鼠移植瘤Ki67 阳性表达率，降低移植瘤裸鼠模型肿瘤质量、体积的作用，提示miR-98-5p 可抑制SCC-25细胞增殖，抑制裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长。

细胞凋亡受阻是恶性肿瘤发生的重要机制，提高细胞凋亡率是阻止癌症发展的有效方法[11]。Bcl-2 和Bax 分别是Bcl-2 家族中最有代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因，在肿瘤细胞凋亡中具有重要的调控作用[12]。Bcl-2 与Bax 的比值作为检测细胞凋亡的常用指标，Bax/Bcl-2 比值的增加意味着凋亡被促进。Wang 等[13]报道miR-98-5p 表达升高，显著诱导头颈部鳞状细胞癌细胞的凋亡。本研究结果显示，miR-98-5p 表达升高，具有升高SCC-25 细胞凋亡率和Bax/Bcl-2 比值的作用，提示miR-98-5p 可促进SCC-25 细胞凋亡。

各类恶性肿瘤中含有肿瘤干细胞亚群，肿瘤干细胞具有自我更新和多向分化潜能，这使得肿瘤干细胞能够重构原发性肿瘤组织的细胞异质性[14]。目前已有大量的研究证实了miRNAs 在多种肿瘤干细胞中发挥了重要调控作用。Yu 等[15]报道抑制miR- 204 可促进口腔鳞状细胞癌干细胞增殖、EMT 性状和淋巴结转移。Ghosh 等[16]报道miRNAs 主要通过调节口腔鳞癌中的肿瘤干细胞和EMT 在顺铂耐药性中发挥重要作用。本研究结果显示，miR-98-5p表达升高，具有降低SCC-25 细胞成球体积、成球数目的作用，提示miR-98-5p 可抑制SCC-25 细胞干样细胞自我更新能力。

STAT3 持续活化及异常高表达，与肿瘤的发生发展及不良预后密切相关。STAT3 异常表达与口腔鳞状细胞癌的发生、浸润、转移有关[17]。刘慧琳等[18]研究显示miR-98-5p 通过下调STAT3 表达，抑制A549 细胞增殖和侵袭能力，同时促进A549 细胞凋亡。Liu 等[19]研究显示microRNA-98 通过靶向STAT3抑制鼻咽癌中的细胞增殖和侵袭。本研究结果显示，体内外实验中miR-98-5p表达升高，均具有降低p-STAT3/STAT3水平的作用，提示miR-98-5p可抑制SCC-25细胞和裸鼠肿瘤组织STAT3磷酸化。

综上所述，miR-98-5p表达上调可促进SCC-25细胞凋亡，抑制增殖、干细胞自我更新能力。这可能是通过抑制STAT3磷酸化实现的。本研究结果显示miR-98-5p在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中起重要作用，为后续研究提供了前期的实验基础，可作为诊断及治疗口腔鳞状细胞癌的潜在生物学指标。