贺成虎，赵海珍陆兆新，吕凤霞，别小妹，张 充

（南京农业大学食品科学与技术学院，江苏 南京 210095）

小麦（Triticum sp.）是在世界各地广泛种植的禾本科植物，是世界上总产量第2的粮食作物，产量仅次于玉米，根据美国食品药品监督管理局的统计数据，2018年世界小麦产量达7.370亿 t左右。我国是全世界最大的小麦生产国和消费国，据国家统计局数据，2018年中国小麦产量达1.283 5亿 t。而麦麸是小麦制粉过程中的主要副产物，相当于小麦质量的15%[1]。因此，2018年仅中国小麦麸皮的产量就达192.5亿 kg。在传统的农业生产中麦麸作为面粉加工的副产品，多用于牲畜饲料。然而随着食品科学技术的发展，人们发现麦麸中含有丰富的功能性物质，如膳食纤维、植物化学物、矿物质、维生素等，尤其是消费者更接受天然营养强化剂，麦麸在食品加工中具有越来越重要的开发价值[2]。

尽管越来越多的研究表明全麦和富含纤维的食物对健康有益，但大多数消费者仍然更喜欢精制白面粉，因为添加麸皮的制品在口感、质地、外观等方面都受到了不利影响，虽然增添了营养性和功能性，但对消费者并不具有很强的吸引力[3-5]。对谷物麸皮进行发酵已被证明是一种可行的预处理方法，不仅可以改善富含麸皮产品的感官品质，还可以提高其营养和功能特性，实现其在食品生产中的应用[6]。对谷物麸皮进行发酵时主要依靠外源或内源微生物进行，具体包括添加外源乳酸菌、酵母菌等菌体的接种发酵法和依靠内源菌的自然发酵法和back-slopping法。Călinoiu等[7]采用酵母对小麦麸皮和燕麦麸皮进行固态发酵，可以显著提高2 种麸皮中的酚酸含量及其抗氧化活性。Decimo等[4]对玉米麸皮进行自然发酵，发现发酵过程中乳酸菌和酵母菌是优势菌，发酵可以促进纤维部分的降解，提高膳食纤维和阿魏酸的含量，降低植酸含量。Manini等[8]采用back-slopping法对麦麸进行酸面团样自然发酵，连续进行13 d直至微生物群落达到稳定（乳酸菌109CFU/g、 酵母菌107CFU/g），结果发现发酵麦麸中可溶性膳食纤维含量增加了30%，水溶性阿拉伯木聚糖和游离阿魏酸含量分别比未发酵麦麸高4 倍和10 倍，植酸被彻底降解。发酵法不仅可以改善麦麸的营养和功能特性，还可以提高麦麸及其制品的安全性。Moran等[9]通过back-slopping方法对小麦进行发酵，发现此法可以在24 h后有效去除或降低其中的大肠菌群，从而降低食源性大肠杆菌病的风险。Katina等[10]将植物乳杆菌和戊糖片球菌应用于麦麸发酵面团中，抑制了枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的生长。自然发酵的谷物麸皮可获取丰富的微生物菌种。尽管目前相关分离纯化菌种的研究报道也非常多，但自然发酵麸皮中微生物多样性还没有得到鉴定。

高通量测序可以准确识别不同食物基质中的复杂微生物，目前已经广泛应用于许多发酵食品例如豆豉[11]、泡菜[12]、酸菜[13]和发酵香肠[14]等的微生物群落分析研究中。通过高通量测序，宏基因组学可以通过靶向检测样品的总DNA，并识别具有流行率的优势菌群。它不仅可以提供有关微生物群落结构的信息，还可以提供基因的功能组成和分布[15]。目前宏基因组学已成功应用于发酵食品研究，但尚鲜有关于麦麸发酵过程中微生物菌群组成和变化的报道。因此，本研究拟采用高通量测序法研究麦麸back-slopping方式自然发酵过中微生物菌群组成的变化情况，为从麦麸中获取有益菌株及通过发酵改善麦麸品质、提高其安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

麦麸样品购于河南新乡。

1.2 仪器与设备

Orion Star pH计 美国Thermo公司；PYX-DHS-50X65-隔水式恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；SWCJ-U-超净工作台 苏州安泰公司；AY120电子天平 日本岛津公司；GXZ-9240 MBE鼓风干燥箱 上海博迅医疗设备有限公司；ZD-88-4-双层落地恒温振荡器 太仓市光明实验分析仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 发酵麦麸样品的制备

将28 g未灭菌麦麸与72 mL无菌水混匀后在37 ℃自然发酵24 h，获得发酵麦麸作为样品1，从样品1中取出一部分发酵麦麸作为接种菌剂用于新的麦麸发酵（backslopping），依次类推，连续发酵培养7 个批次，发酵条件与样品1相同，取样品1和发酵批次为3、5和7的麦麸，一共4 组发酵麦麸样品，分别编号为1#、3#、5#和7#，经保鲜袋密封包装后放置于-70 ℃冰箱保藏。将4 组发酵麦麸样品委托北京奥维森生物公司进行高通量测序。

1.3.2 细菌和真菌Illumina MiSeq测序

测序使用Illumina MiSeq测序平台对细菌16S rDNA V3-V4区和真菌ITS1区序列进行测序。细菌16S rDNA V3-V4区的通用引物为338F（5’-ACTCCTACGGGAGGGAG-3’）和806R（5’-GGACTACHV GGGTWTCT-3’）；真菌引物为ITS1F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和2043R（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）。测序数据经拼接、过滤、剔除嵌合体，舍弃低质量序列等得到精准分析的优质序列，优质序列用于可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）与多样性指数计算及物种丰度分析。

1.4 数据分析及图像处理

1.4.1 α多样性分析

α多样性是用来分析单一样品的复杂程度，即单一样品中的群落多样性程度。根据OTU聚类分析的结果，采用Qiime（v 1.8）在OTU相似水平97%的条件下评估α多样性指数，包括OTU数量、Shannon指数、Chao1指数和覆盖率。其中Shannon指数描述样品中微生物的多样性，Chao1指数描述菌群的丰度，这两个参数值越大，说明样品复杂程度越高。覆盖率是反映测序深度的指数之一，数值越高说明样本中序列被测出的概率越高。

1.4.2 群落组成分析

利用RDP Classifier算法对获得的OTU代表序列进行物种分类注释，并与Silva数据库进行比对，选取不同的分类水平进行群落组成的统计分析，根据分析结果，通过Graphpad prism 7.0、Mev 4.90和JMP trial 14.0软件绘制样品优质序列分布图、稀释性曲线、菌群分布柱状图、热图、主成分分析（principal component analysis，PCA）图等可视化方法研究样品中微生物群落组成及关系。

2 结果与分析

2.1 发酵麦麸样品的测序结果质量分析

采用高通量测序获得发酵麦麸样品的原始序列数据后，经过Trimmomatic、FLASH等软件优化数据后得到了4 个样品共97 666 条细菌有效序列，真菌有效序列为143 845 条。经数据预处理最终得到的细菌优质序列分布统计见图1A，测序长度主要集中在400～440 bp的区间长度内，与设计引物扩增长度相似；真菌优质序列分布统计见图1B，测序长度主要集中在240～320 bp的区间长度内，与设计引物扩增序列长度为300 bp左右接近，总体测序结果说明本次测序结果较合理。

图1 高通量测序中细菌（A）和真菌（B）的优质序列分布Fig. 1 High quality sequence distribution of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

2.2 α多样性分析

2.2.1 稀释曲线

图2 高通量测序中细菌（A）和真菌（B）的稀释性曲线Fig. 2 Rarefaction curves of bacteria (A) and fungi (B) in high-through sequencing

稀释曲线反映测序深度情况，客观地判断测序数据量是否合理，并间接反映样品中物种的丰富程度。当曲线趋于平缓时表明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种。如果曲线趋于平坦则表明测序已趋于饱和，更多的测序数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明不饱和，继续测序还可能产生更多新的OTU。根据图2可知，各发酵麦麸样品的稀释曲线随测序深度的增加呈现先直线上升后缓慢上升直至曲线趋向平坦，说明在样品进行测序过程中所选的测序数据量已经足够大，可以反映样品中绝大多数的微生物菌群信息，再增加测序深度也无法找到更多的OTU，发酵麦麸样品的菌群多样性也不会发生改变。

2.2.2α多样性指数分析

4 组发酵麦麸样品中，细菌有效序列的最小数量为18 060 条，真菌有效序列的最小数量为29 144 条（表1、2）。为了方便分析，所有细菌序列标准化为15 781 条，真菌序列标准化为28 759 条。OTU是系统发生学或群体遗传学研究中一个假定分类单元，通过归类操作，将序列相似性大于等于97%的归为一个OTU，每个OTU对应于一个不同的微生物种，OTU数量可以代表样品物种的丰富度。对样品进行细菌OTU聚类分析，共产生262 个OTU；而真菌共产生291 个OTU。

表1 4 组发酵麦麸样品细菌菌群多样性指数比较分析Table 1 Comparative analysis of the bacterial diversity indexes of four groups of fermented wheat bran samples

表2 4 组发酵麦麸样品真菌菌群多样性指数比较分析Table 2 Comparative analysis of the fungal diversity indexes of four groups of fermented wheat bran samples

由表1可知，在4 个样品中，细菌OTU数量最多可达到178，最少为153。且随着发酵批次的增加，细菌OTU数量先增加后降低再增加，但整体是增加的趋势，这表明麦麸发酵样品随发酵批次的增加丰富度逐渐增加且不同发酵批次的菌群丰富度差异较大，其中7#样品的丰富度最高。由表2可知，真菌的OTU数量最多可达到146（3#），最少为118（1#），5#和7#的OTU数量相当，但均低于3#，说明发酵麦麸样品中不同批次间的菌群丰富度差异较大，但比发酵初期的丰富度均有增加。

Chao1指数值越大说明样品中微生物群落的丰度越高，根据表1结果，随着发酵批次增加，Chao1指数先增后减，再增加，说明随着发酵进行，麦麸样品中细菌群落丰度变化较大。Shannon指数先增高后降低再增高，说明随着发酵的进行麦麸中细菌群落多样性发生了比较明显的改变。4 个样品的覆盖率均不低于99.7%，说明样品中的序列基本完全被测出，测序结果代表了样品中微生物的真实情况。

如表2所示，真菌的Chao1指数随发酵批次增加，表现出先增后减的趋势；而Shannon指数从发酵第1天1#样品的2.768降低到5#样品的最小值2.173；随后7#样品的Shannon指数达到最大值4.280，说明5#样品真菌群落组成最为简单，而7#样品中的真菌群落组成最为复杂。4 个发酵样品中真菌的Shannon指数整体高于细菌，说明麦麸发酵过程中真菌的多样性远高于细菌，而Chao1指数远低于细菌，说明发酵麦麸中真菌丰度远低于细菌。覆盖率均为99.9%，表明测序数据能够覆盖目前状态下样品中的真菌种类，能真实反映样本中的菌群落情况，可用于后续分析。

2.3 物种组成分析

2.3.1 基于门水平的发酵麦麸菌群结构分析

图3 发酵麦麸中细菌（A）和真菌（B）门水平的群落分类学组成和相对丰度分布Fig. 3 Phylum-level composition and abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

根据得到的每个OTU在不同分类水平的物中分类信息，分析样本OTU在不同分类水平上的群落结果。如图3A所示，在门分类水平上，4 个麦麸发酵样品共检测到4 个细菌门类，分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、Streptophyta以及其他未分类的门。Firmicutes是麦麸发酵整个过程中的绝对优势菌门，发酵起始时其平均相对丰度为13%，发酵第7批次后达到90%，随发酵过程进行，相对丰度先升高后趋于稳定。Proteobacteria在发酵起始时占较高比例（86%），随发酵进行其相对丰度逐渐降低。其他菌门相对丰度很低，但是在发酵过程中一直存在。如图3B所示，在门分类水平上，4 组发酵样品共检测到4 个真菌门，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、球囊菌门（Glomeroamycot）和Streptophyta以及无法归类的真菌。Ascomycota在4 组发酵麦麸中的相对丰度分别为93.38%、83.82%、90.81%和79.67%，在整个发酵过程中一直处于绝对优势地位。

2.3.2 基于属水平的发酵麦麸菌群结构分析

图4 发酵麦麸中细菌（A）和真菌（B）属水平的群落分类学组成和相对丰度分布Fig. 4 Genus-level composition and relative abundance distribution of bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

在属分类水平上，以相对丰度≥1%为阈值，4 个样本共检测到10 个细菌属和13 个真菌属，将相对丰度低于1%的合并为一类（others）。从图4A可以看出，乳酸杆菌属（Lactobacillus）和片球菌属（Pediococcus）是麦麸发酵过程中的绝对优势菌属。在1#、3#、5#、7#样品中，Lactobacillus和Pediococcus二者相对丰度分别为1.5%、29.74%、60.58%、50.36%和0.9%、60.45%、29.04%、39.62%，相对丰度随发酵批次增加先升高后趋于稳定。其他菌属如假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）和梭菌属（Clostridium）等只在发酵前期大量存在，发酵后期所占比例降低。从图4B可知，麦麸自然发酵过程中在属水平上主要有曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、链格孢属（Alternaria）和镰刀霉属（Fusarium）。在麦麸发酵过程中，真菌优势菌群变化较大，1#样品中以Aspergillus为主，其次为Alternaria；发酵后期以Alternaria为主，同时Aspergillus和Penicillium相对丰度下降。

2.4 相似性聚类分析

图5 发酵麦麸样品的细菌（A）和真菌（B）属水平的分布热图Fig. 5 Heatmaps of genus-level distribution bacterial (A) and fungal (B) communities in fermented wheat bran

在属分类水平下，将细菌和真菌的群落组成按照其在4 组样品中的最大相对丰度排序，并取出排在最前的20 个属绘制物种丰度聚类热图。从图5可以看出，3#、5#和7#样品的细菌菌群丰度最为接近，主要是以Lactobacillus和Pediococcus为主，而1#样品的细菌菌群丰度与其他样品有明显不同，主要是以大肠杆菌属（Enterobacter）、泛菌属（Pantoea）和克罗诺菌属（Cronobacter）等为主。而对于真菌菌群分布来说，整个发酵过程主要以Aspergillus和Alternaria为主，其他真菌如Penicillium、Fusarium等一直存在于在整个发酵过程中，但是相对丰度很低。热图分析表明，不同发酵批次的麦麸样品中细菌和真菌菌群丰度明显不同，这说明发酵批次对菌群丰度影响很大。

2.5 细菌和真菌群落的PCA

图6 发酵麦麸样品的细菌（A）和真菌（B）PCAFig. 6 PCA of bacteria (A) and fungi (B) in fermented wheat bran samples

对各组样品中细菌和真菌的主要差异OTU（相对丰度＞1%）进行PCA，分析不同样品中细菌和真菌的主要差异OTU与PC的关系。图6表示不同样品和主要差异OTU的双标图，即不同样品与其主要差异菌属之间的关系。可以看出，发酵批次的不同对麦麸细菌和真菌菌群组成有一定的影响，细菌PC1和PC2对样本差异性的贡献分别达到了92.3%和7.7%，共计99.98%，真菌PC1和PC2对样本差异性的贡献分别达到了62%和25.9%，共计87.9%，可以代表绝大部分变量信息。在PCA中，各个点之间的距离越大，表明它们之间的菌群差异越大。在细菌和真菌的PCA中，1#样品点与聚集在一起的3#、5#和7#样品点之间的距离很远，这说明1#样品与3#、5#和7#样品的菌群组成差异较大，3#、5#和7#样品的的菌群组成相似。对于细菌PCA，1#样品点分布在PC1的正半轴，3#、5#和7#样品点分布在PC1的负半轴；Cronobacter、Pantoea、Clostridium、Enterobacter和Escherichia分布在PC1的正半轴，Pediococcus和Lactobacillus分布在PC1的负半轴；这说明1#样品的菌群变化主要是Cronobacter、Pantoea和Clostridium等菌属存在，3#、5#和7#样品的菌群变化主要是Pediococcus和Lactobacillus存在。同时Pediococcus和Lactobacillus之间呈正相关，与其他菌属如Cronobacter、Pantoea和Clostridium等呈负相关。

对于真菌PCA，1#和5#样品对PC1轴的贡献较大，分布在PC1轴的负半轴和正半轴；Aspergilus和Penicillium与Alternaria、附球菌属（Epicoccum）、锁掷酵母属（Sporidiobolus）等菌属呈负相关，并且分布在PC1轴的负半轴和正半轴，说明这些菌属对于1#和5#样品的菌群变化影响最大。3#样品对PC2轴的贡献较大，分布在PC2轴的上侧，而散囊菌属（Eurotium）也位于PC2轴的上侧，这说明除上述菌属外，Eurotium也是造成3#样品与其他批次样品的菌群不同的重要因素。而7#样品对PC1、PC2的贡献相差不大，这说明上述菌属都是能够显著影响样品菌群变化的因素。

3 讨 论

发酵麦麸中的菌群组成非常复杂，其种类多、数量大、范围广。目前，有关针对麦麸发酵过程中的菌群变化的研究较少，本研究通过高通量测序方法分析了麦麸发酵过程中的细菌和真菌的多样性变化情况。在细菌方面，4 组样品共获得262 个OTU，多样性指数最大的样品为1#，最小的样品为5#，发酵麦麸中的细菌分布在4 个门，10 个属，且存在部分细菌16S rDNA序列未能分类。在真菌方面，4 组样品共获得291 个OTU，发酵麦麸中的真菌分布在4 个门，13 个属。

麦麸发酵过程中，细菌和真菌菌群高度丰富，有大量未命名的且不可培养的微生物，且不同样品之间存在一定的差异。在1#样品中，Proteobacteria是绝对优势菌门，而Firmicutes是其他3 个back-slopping样品中的绝对优势菌门。属水平上1#样品中Cronobacter、Pantoea、Enterobacter和Clostridium为优势菌，3#、5#和7#样品中Lactobacillus和Pediococcus是绝对优势菌属。1#样品和其他3 个样品不论是在门或属水平上微生物群落组成都存在比较大的差异，这种差异可能是因为发酵方式不同造成，1#样品是通过自然发酵获得的发酵麦麸样品，而其他3 个样品是以1#样品为发酵菌剂通过back-slopping方式获得的自然发酵麦麸。有研究者认为back-slopping方式消除了种共存中的扩散限制，选择了具有高度竞争性的菌群[16]。Manini等[8]在麦麸自然发酵过程中（18 ℃，24 h）发现弯曲乳杆菌和戊糖乳杆菌作为麦麸内源细菌并且直至发酵结束一直占据主导地位；Abedfar等[17]在自然发酵的伊朗北部麦麸中发现植物乳杆菌和片球菌为主要菌群，并且它们产胞外多糖能力也大不相同。由此可见，乳酸菌广泛存在于麦麸发酵过程中，这可能与乳酸菌的代谢和生理学特性有助于其在发酵中进行竞争性生长相关[18]。麦麸发酵是一个相对开放的发酵过程，其麦麸原料并未经过任何筛选和灭菌处理，所以在发酵过程中可能存在大量杂菌生长的现象，从而影响到发酵麦麸的品质。麸皮表面有比胚乳面粉含量更多的微生物，它们可能是腐败细菌和真菌的来源[19]。本研究中，在发酵第1批次的麦麸内检测到大量Enterobacter和Clostridium等有害菌存在，但在后续的转接发酵过程中仅检测到微量，这说明此发酵过程中的微生态环境变化，尤其pH值的降低（大量乳酸菌生长产生有机酸酸所致），能够有效抑制有害菌的生长繁殖[20]。Katina等[21]在用酵母发酵黑麦的过程中发现，内源乳酸菌的大量生长以及其产生的大量有机酸和抗菌物质，限制了其他需氧异养细菌的生长。这些结果与普遍接受的观点一致，即传统发酵由少数微生物物种主导，这些微生物物种是在发酵过程中基于食物基质特性和适应自身生理代谢而选择的[22]。

麦麸发酵过程中的真菌在属水平上主要有Aspergillus和Alternaria。Alternaria是一种常见的植物致病菌，可引起食物霉变，但同时也是一种有应用潜力的生物资源，如某些链格孢种高产纤维素酶，这对于改善谷物膳食纤维含量具有良好作用。Aspergillus也是一种重要的发酵菌，广泛应用于制曲、酿酒等方面，其所属的部分菌种高产蛋白酶，糖化酶等有利于发酵过程中生物活性物质的增加[23]。本研究检测到的某些真菌如Penicillium和Fusarium是谷物中的常见腐败菌。在麦麸发酵的后期，其种类和数量都急剧降低，这可能与乳酸菌的大量繁殖生长相关。乳酸菌能够产生细菌素、乳酸、乙酸和过氧化氢等抗细菌和抗真菌化合物，可以防止食品腐败并延长食品的保质期[24]。Lavermicocca等[25]发现Lactobacillus能够产生抗真菌的苯基乳酸，它可以延迟黑曲霉和青霉菌生长达7 d，并显著延长面包的保质期。在本研究中，并未检测出酵母菌属的存在，而在以往的发酵麦麸研究中，经常可以检测到酵母菌的存在。Manini等[8]在自然发酵的意大利麦麸中发现有毕赤酵母（Pichia pastoris）存在；Berghofer等[26]发现大肠杆菌、酵母菌和霉菌是澳大利亚小麦中最常检测到的微生物，这些可能与麦麸的种类、产地和储藏环境等因素相关。在麦麸发酵研究中发现，整个发酵过程中样品细菌的Shannon指数低于真菌，说明发酵麦麸样品中细菌的多样性不如真菌，但细菌的Chao1指数整体高于真菌，说明发酵样品中细菌的丰度远高于真菌，且随发酵批次增加，细菌中以Lactobacillus和Pediococcus等有益菌为主，Alternaria等致病菌丰度逐渐降低，说明对麦麸进行不同批次自然发酵可以改变其微生物菌群多样性及丰度，抑制有害菌的生长，这说明发酵环境条件越来越具有选择性，最终适合于少数菌种的生长[27]，也表明更新批次、发酵时间或pH值会影响某些菌种的优势[28]，这与Menezes等[29]对酸面团中细菌群落变化的趋势一致。Menezes等[29]还发现，发酵温度对酸面团中菌群的变化起着重要的作用，就本研究而言，这需要后续进一步的实验探究。

研究采用高通量测序分析方法对传统自然发酵麦麸和back-slopping自然发酵麦麸的微生物群落组成和多样性进行分析。结果表明，不同发酵方式会影响麦麸中优势菌群的种类及组成比例。在门水平菌群变化中，随backslopping发酵批次可以有效增加细菌中Firmicutes含量，减少Proteobacteria的含量；真菌方面Asconycota是整个发酵过程中的绝对优势菌，但其多样性随back-slopping发酵批次增加变得丰富。在属水平菌群变化中，随back-slopping发酵批次增加，麦麸中Enterobacter、Cronobacter、Clostridium等有害菌减少，Lactobacillus和Pediococcus成为优势菌；真菌方面Aspergillus相对丰度降低，Alternaria相对丰度有所增加。整体而言，back-slopping发酵能提高麦麸的微生物菌群多样性，在一定程度上促进有益菌的增加，并抑制有害菌的生长繁殖。故这种发酵方式有利于谷物麦麸中乳酸菌的逐步筛选，并加速发酵，缩短发酵时间，具有适用于工业化生产的优势。目前的大多数研究主要集中于发酵麦麸中乳酸菌和酵母菌的作用，忽略了其他菌群的作用，关于谷物麸皮酸面团样品发酵过程中微生物菌群变化研究应该促进非典型微生物方面的探讨，包括潜在致病菌及其对发酵麦麸品质的影响。考虑到麦麸中含有膳食纤维、多酚等生物活性物质，发酵过程中细菌和真菌的丰富度和多样性变化趋势定会对麦麸发酵产品中的活性成分产生影响，因此后期将对麦麸产品发酵过程中成分变化进行深入研究。