刘若冰，郝怡环，杨 茜，焦文雅，王向红

（河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000）

恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）又名乙基环丙沙星，是目前使用较为广泛的一种氟喹诺酮类抗生素药物。多用于治疗动物感染性疾病，不管是对革兰氏阴性菌，还是革兰氏阳性菌都有较好的杀灭作用[1]。在水产养殖和畜牧领域也有较为广泛的应用，常用于治疗小猪仔白、黄痢和鱼类弧菌症等疾病[2]。同样能够抑制如梭状杆菌、短小芽孢杆菌、消化链球菌等致病菌的繁殖[3-4]。但随着这种药物的过量使用，动物源性食品中ENR残留问题常有发生[5]，当在人体内蓄积到一定浓度时就会产生毒性作用[6]，可能还会导致人体过敏反应或产生其他比如过敏性哮喘[7]、头痛[8]、恶心、呕吐等人体不适的副作用[9]。因此，亟需建立一种快速、灵敏的食品中ENR的检测方法。

目前用于检测ENR的方法主要有高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]、免疫分析法[12]、毛细管电泳法[13]以及微生物法[14]等。这些方法虽具有较高的检测灵敏度，但由于受到样品前处理过程繁琐、操作复杂、设备要求高等限制，使其不能广泛地用于食品的快速检测。核酸适配体是通过体外指数富集配体系统进化技术筛选出的能够与无机或有机分子、蛋白等目标物发生高亲和性和特异性结合的一类单链核苷酸（DNA或RNA）[15]。它的获取不依赖于生物体或细胞[16]，是兽药残留检测领域的一个主要研究方向[17-19]。针对ENR的适配体检测方法目前已有很多，赵秋伶等[20]研制了ENR酶联适配体分析检测试剂盒；赵银丽等[21]建立了胶体金核酸适配体比色法；Dolati等[22]利用氧化石墨烯通过荧光共振能量转移机制对附近荧光物质的荧光猝灭建立了一种基于核酸适配体的ENR荧光检测方法。这些方法快速、简单、灵敏，已经被广泛用于开发便携和现场使用的快速检测。

AccuBlue是一种极为灵敏的荧光核酸染料[23]，常用于双链DNA（dsDNA）的定量检测。AccuBlue在游离状态，或与单链DNA（ssDNA）共存时只发出微弱的荧光，与dsDNA共存时会与之发生结合使得荧光信号显著增强。Duan Nuo等[24]基于AccuBlue的识别特性进行了副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的检测，但目前并没有适用于小分子物质检测的报道。

本研究基于AccuBlue对痕量dsDNA的超敏感性和ENR核酸适配体建立检测ENR的非标记型荧光分析方法，并用于实际样品的测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛奶、虾肉、牛肉 市购；E N R、氧氟沙星（ofloxacin，OFL）、环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、依诺沙星（enoxacin，ENX） 上海源叶科技有限公司； 牛血清蛋白（bovine serum protein，BSA） 美国Sigma公司；AccuBlue染料 美国Biotium公司；酶标抗原、ENR抗体（0.996 mg/mL）均为实验室制备。

参照文献[25]合成ENR的核酸适配体及其互补链Complementary DNA（表1）。

表1 寡核苷酸名称与序列Table 1 Oligonucleotides used in this study

1.2 仪器与设备

LUX多功能酶标仪、1500-823多功能酶标仪 美国 Thermo Scientific公司；F-750分光光度计 日本日立公司；1260液相色谱仪 安捷伦科技有限公司； SKP-02.300电热恒温培养箱 天津泰斯特有限公司；TGL-40B台式低速离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 原理

AccuBlue是一种定量检测dsDNA的染料，灵敏度较高，当它与dsDNA结合后，荧光强度会在短时间内达到峰值，荧光强度会增强1 000 倍以上，并且不与ssDNA结合。向含有核酸适配体的缓冲液体系中加入ENR，核酸适配体就会与之结合，能结合ENR的适配体空间结构就会改变，使之不能再与其互补链碱基互补配对。不能与ENR特异性结合的核酸适配体与反应体系中核酸适配体互补链杂交生成dsDNA。AccuBlue不结合单链核苷酸，仅识别dsDNA的螺旋沟结构，从而释放荧光信号。结合原理如图1所示，向相同浓度的核酸适配体体系中添加不同浓度的ENR，反应体系中的荧光强度不同，因此，可以借助荧光信号强度的变化确定样品中ENR浓度，从而实现快速定量检测ENR的目的[26]。

图1 AccuBlue荧光法反应原理示意图Fig. 1 Schematic diagram showing the principle of AccuBlue fluorescence reaction

1.3.2 AccuBlue对ENR核酸适配体形成的dsDNA的检测

分别取10 μL 10 nmol/LENR 核酸适配体与Complementary DNA溶液，95 ℃加热5 min，冰浴10 min，恢复至室温。然后加入到96 孔黑色酶标板中混匀，25 ℃反应10 min。再加入200 μL AccuBlue荧光染料避光反应5 min，利用多功能酶标仪的荧光功能检测荧光强度（参数设置：激发波长为468 nm，发射 波长为507 nm）。

1.3.3 双链孵育时间及AccuBlue识别时间的优化

将ENR核酸适配体与Complementary DNA溶液经预变性后加入反应体系，在25 ℃培养箱中分别反应5、10、15、20、25、30 min，再分别加入200 μL AccuBlue荧光染料，固定孵育时间后通过多功能酶标仪连续20 min检测荧光强度。

1.3.4 ENR定量检测

将0、20、50、100、500、1 000 μg/L和2 000 μg/L系列质量浓度的ENR溶液与ENR核酸适配体溶液在孔内混匀，25 ℃孵育10 min，再加入Complementary DNA溶液和AccuBlue，重复3 次检测荧光强度。ENR药物质量浓度为0时体系中荧光强度用F0表示。以ENR药物质量浓度的对数为横坐标，以F/F0为纵坐标，建立标准曲线。

1.3.5 特异性实验

按照1.3.2节方法分别测定终质量浓度为1 000 μg/L ENR、OFL、CIP、ENX溶液体系的荧光强度，重复3 次，结果与空白对比。

1.3.6 实际样品的检测

称取5.0 g脱脂奶粉溶于 10 mL的1×PBS，经14 000 r/min离心20 min，保留上清液用Tris缓冲液进行10 倍的稀释。选取虾肉和牛肉可食用部分剁碎混匀，准确称取5.0 g肉样，加入无水硫酸钠5.0 g研磨均匀后加入提取溶剂（4 mL乙腈、0.04 mL乙酸）于3 000 r/min离心12 min，保留上清液；将残渣重复上述操作1 次，合并上清液后氮气吹干，再用Tris缓冲液溶稀释20 倍[27]。然后向样品中添加终质量浓度为200、500、1 000 μg/L的ENR标准品，经优化好的方法重复3 次测定荧光强度值，计算添加回收率。

1.3.7 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）及HPLC验证

基于抗体的ELISA方法样品前处理为将15 g奶粉溶解于15 mL磷酸盐缓冲溶液（1×PBS），加入5 mL三氯乙酸，5 000 r/min离心15 min，保留上清液，调节pH值为中性。准确称取虾肉与牛肉均质样本1.0 g，加入5 mL 1%氨水的乙腈溶液及2.5 mL正己烷，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min，弃去上层有机相，将提取液氮气吹干，缓冲液复溶。ENR加标量分别设定为200、500、1 000 µg/kg 3 个水平，重复3 次测定样品中ENR含量，计算回收率。

HPLC在参考文献[28-30]中ENR测定方法的基础上稍作修改，建立了奶粉、虾肉、牛肉中ENR检测的HPLC法。样品处理方法为准确称取10 g奶粉溶于10 mL磷酸盐缓冲溶液，加入35 mL乙腈，超声提取30 min后加入200 g/L乙酸锌2.0 mL，乙腈定容至50 mL，10 000 r/min离心5 min，收集上清液经0.22 μmol/L有机滤膜过滤；准确称取虾肉与牛肉均值样本2.00 g，分别加入12 g无水硫酸钠和12 mL酸化乙腈，超声提取15 min，4 500 r/min离心15 min，收集上清液移至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振荡5 min。充分静置后，将下层液体55 ℃旋转蒸发至干。用1 mL流动相充分溶解残渣，4 500 r/min离心5 min，保留上层溶液，经0.45 μm膜微孔过滤。待测样品经HPLC仪重复3 次进行测定。HPLC分析条件为：Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；流动相：0.05 mol/L的磷酸三乙胺-乙腈（pH 3）（82∶18，V/V）；流速：1 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：激发波长280 nm，发射波长450 nm[31]。ENR的加标量分别设定为200、500、1 000 µg/kg 3 个水平。

将ELISA方法和HPLC方法测定结果与荧光法检测结果进行比较，分析相关性。

1.4 数据统计及图表绘制

使用Excel 2010及Origin 2017软件进行数据统计和图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 AccuBlue对ENR核酸适配体形成的dsDNA的检测

建立基于AccuBlue荧光染料和核酸适配体方法检测ENR的前提是确定AccuBlue与缓冲液、适配体和互补链之间形成的双链核苷酸反应后是否释放荧光，该荧光信号是否可以被仪器识别。AccuBlue对ENR核酸适配体形成的dsDNA检测结果如图2所示，缓冲液本身不具有荧光信号且ENR核酸适配体与Complementary DNA的杂交产物dsDNA结合AccuBlue释放的荧光信号远大于AccuBlue荧光染料本身，且由此可以证明，利用AccuBlue荧光检测ENR方法可行。

图2 ENR核酸适配体形成的dsDNA与AccuBlue结合后的 荧光检测（n=3）Fig. 2 Fluorescence intensity of AccuBlue in the presence and absence of ENR aptamer hybridizer (n = 3)

2.2 双链孵育时间及AccuBlue识别双链时间的优化

荧光染料AccuBlue通过识别核酸适配体与其互补链之间的碱基配对位点，在初始阶段随着反应时间的推移，释放出的荧光信号不断增强，直到反应体系中AccuBlue与dsDNA不再结合为止。双链孵育时间优化结果如图3所示，ENR核酸适配体与其互补链反应10 min时，体系中相对荧光强度达到最大值，且处于稳定状态。因此确定ENR适配体与其互补链、ENR药物的孵育时间为10 min。

图3 ENR核酸适配体与其互补链孵育时间优化（n= 3）Fig. 3 Optimization of incubation time of ENR aptamer and its complementary chain (n = 3)

当加入体系中的AccuBlue和ENR核酸适配体浓度一定时，需要确定在当前浓度条件下荧光强度达到峰值的时间。荧光染料识别双链的时间优化如图4所示。相对荧光强度在第6分钟时达到最高点且处于稳定状态。AccuBlue荧光染料的浓度一定时，相对荧光强度随dsDNA的增多而增强，达到峰值之后又有轻微的猝灭。因此，选择6 min作为AccuBlue与样品的最优反应时间。

图4 荧光染料识别双链的时间优化（n=3）Fig. 4 Optimization of reaction time between AccuBlue and dsDNA (n = 3)

2.3 ENR定量检测结果

根据上述确定的最佳反应条件，建立AccuBlue荧光法检测不同质量浓度ENR的标准曲线。当ENR核酸适配体的量一定时，ENR质量浓度越大，体系中能与互补链结合的核酸适配体越少，形成的dsDNA越少，AccuBlue识别dsDNA产生的荧光强度F值越小。溶液中没有ENR药物存在时，核酸适配体完全与其对应的互补链结合，此时荧光强度F0最大。因此，以F/F0为纵坐标，以ENR质量浓度的对数值为横坐标建立标准曲线。该方法的标准曲线为Y＝-0.186 8x＋1.186，R2＝0.945 7。ENR在20～1 000 μg/L的质量浓度梯度范围内存在良好的线性关系，检出限为9.96 μg/L，定量限为29.97 μg/kg。此外，由表2可知，该方法的平均板内变异系数为6.63%，平均板间变异系数为8.05%。目前应用于ENR的荧光检测方法还有很多。对比文献报道的其他荧光分析方法 （表3）可以看出，本实验建立的AccuBlue荧光法线性范围较宽、检测限低，且AccuBlue免标记，操作简便，整个实验过程不超过1.5 h。

表2 板内与板间变异实验（n=6）Table 2 Inter-plate and intra-plate coefficients of variation (n = 6)%

表3 ENR不同荧光检测方法结果比较Table 3 Comparison of different fluorescence methods for enrofloxacin detection

2.4 特异性实验结果

图5 AccuBlue与ENR核酸适配体检测ENR的特异性分析（n=3）Fig. 5 Specificity evaluation of AccuBlue and ENR aptamer for the detection of ENR (n = 3)

为了考察ENR的核酸适配体与其他结构类似物是否发生交叉反应，同时对ENR、CIP、OFL、ENX进行了检测，结果如图5所示。当向反应体系中加入相同质量浓度（1 000 μg/L）的抗生素药物时，AccuBlue检测ENR的反应体系所释放的荧光强度小于其他3 种。这说明反应体系内中有ENR存在时，ENR核酸适配体与ENR发生了特异性结合，只能激发产生少量荧光。而其他抗生素反应体系中，ENR核酸适配体几乎与互补链完全结合，与AccuBlue结合激发产生更多的荧光。由此可知，ENR核酸适配体可特异性识别并结合ENR，与CIP、OFL、ENX基本上不发生交叉反应。

2.5 实际样品的检测结果

本实验选取奶粉、虾肉和牛肉3 种样品进行加标回收实验。按照1.3.6节的方法处理样品，每种样品添加3 个不同水平的ENR标准品，用荧光法进行检测，根据标准曲线计算样品回收率。由表4可知，3 种样品的加标回收率范围为76.54%～98.79%。结果表明，该检测方法准确可靠，可用于实际动物性样品中ENR含量的快速检测。

表4 荧光法测定样品的加标回收结果（n=3）Table 4 Recoveries of spiked samples by the fulorescence method (n = 3)

2.6 荧光法与ELISA及HPLC测定结果的相关性分析

为了进一步验证AccuBlue荧光法的准确性，使用ELISA和HPLC方法检测加入ENR标准的相同样品（奶粉、虾肉和牛肉）。ENR标准品及3 种动物食品加标样品的HPLC见图6。3 种方法的线性回归分析结果如图7所示，采用荧光法测定加标样品回收率与其他两种方法都呈现良好的线性关系（R2＞0.96；R2＞0.98），证实了本实验建立的荧光法检测ENR残留方法准确可靠，可应用于实际样品的快速检测。

图6 ENR标准品（a）及奶粉（b）、虾肉（c）、牛肉（d） 样品HPLC图Fig. 6 HPLC chromatograms of ENR standard (a), milk powder (b), shrimp (c), and beef (d) samples

图7 荧光法和ELISA（a）及HPLC（b）测定结果的线性回归分析Fig. 7 Linear regression analysis of fluorescence method versus ELISA (a), and fluorescence method versus HPLC (b)

3 结 论

利用核酸适配体及AccuBlue荧光染料的特点，建立一种基于核酸适配体快速检测ENR的方法，并对荧光法反应体系进行优化。结果表明，本研究建立的AccuBlue适配体方法在pH 8.5的缓冲溶液中，荧光染料识别双链的时间为6 min，双链孵育时间为10 min的最优反应条件下，ENR在20～1 000 μg/L范围内线性关系良好，检出限为9.96 μg/L，定量限为29.97 μg/kg。且与OFL、CIP、ENX无交叉反应，板内变异系数范围为4.97%～9.31%，板间变异系数范围为5.83%～10.96%。在3 个不同水平，样品回收率在76.54%～98.79%之间。通过ELISA方法与HPLC方法进行验证，R2均大于0.96。由此表明，该检测特异性、稳定性和重复性良好。本研究建立的AccuBlue荧光法所需设备简单、成本低、效率高，为食品中ENR的快速和高灵敏检测提供了新的方案。