许随根，李家鹏，李金春，陈 曦，杨君娜，熊苏玥，黄 鑫，乔晓玲，曲 超，王守伟

（中国肉类食品综合研究中心，北京食品科学研究院，国家肉类加工工程技术研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

近年来，随着经济发展，水产类食品越来越受消费者青睐，特别是营养价值较高的金枪鱼和鳕鱼的消费需求在不断增长。同时，鱼肉制品的掺假事件被多次报道，造成消费者的恐慌，掺假行为不仅威胁消费者的健康和造成经济利益受损，还损害渔业及其国际贸易，而且也对监管部门的执法提出了更高技术要求[1]。鱼肉产品掺假或称为标签错误标示是一个全球性的问题[2]，在亚洲、非洲[3]、欧洲[4]、南美洲[5]、大洋洲和北美洲[6-7]等地多国均有报道。银鳕鱼（裸盖鱼，Anoplopoma fimbria）含有大量的不饱和脂肪酸、多种必须氨基酸、多种维生素、钙、镁、硒等营养元素[8]，营养丰富，肉味甘美，易于消化，深受婴幼儿喜爱，常作为辅食食用，市场上具有很高售价。关于裸盖鱼产品掺伪的报道很多，其中油鱼（异鳞蛇鲭，Lepidocybium flavobrunneum）在掺伪鱼类中最引起社会和消费者广泛关注，因异鳞蛇鲭外形酷似裸盖鱼，但其肌肉及内脏富含蜡质油脂，多吃会导致腹泻，严重危害消费者健康[9]。蓝鳍金枪鱼富含二十二碳六烯酸、二十碳五稀酸、酪胺酸、牛磺酸、核酸、铁、钙、钾、多种必须氨基酸和VB12等营养成分[10]，营养价值极高，其肉质细嫩，口感滑腻，有“金枪鱼之王”的雅称[11]，由于每种金枪鱼具有不同的品质和价格，蓝鳍金枪鱼在市场上稀缺，具有很高售价，造成不法商贩以其他近似鱼类以次充好售卖[12]。消费者在购买鱼类产品时多基于鱼鳍、鱼须、体型、鳃耙数、脊骨数等外部形态特征判别鱼种类，而裸盖鱼和金枪鱼产品多以真空包装的切块、切片、腰肉或罐头产品交易，因此监管者和消费者不易通过形态特征判断其所用的原料。针对这类掺假造假的判定，传统的形态特征鉴别法已经不能满足，必须基于更确切、精准的物种鉴别基础上，因此，行业急需一种灵敏、特异的蓝鳍金枪鱼和裸盖鱼及其制品的物种鉴定方法。

现今鳕鱼与金枪鱼的鉴定标准方法国内仅有 SN/T 3589.6—2013《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法 第6部分：金枪鱼成分检测 实时荧光PCR法》和SN/T 3589.7—2013《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法 第7部分：鳕鱼成分检实时荧光PCR法》，金枪鱼、鳕鱼成分检测实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）法，而蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭没有快速的鉴定方法。目前，已经报道的有关金枪鱼、异鳞蛇鲭、鳕鱼的分子鉴定方法有多重PCR琼脂糖电泳法[13-14]、多重PCR联合酶联吸附法[15]、核苷酸测序（forensically informative nucleotide sequencing，FINS）法[16]、DNA条形码法[17-18]、PCR限制性片段长度多态性法（PCR restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[19]和单物种荧光定量 PCR法[20-21]。多重PCR琼脂糖电泳法灵敏度较低，近物种鉴定易出现假阳性，FINS和DNA条形码法需要测序[22]，鉴定周期长，操作繁琐；此外，DNA条形码法还存在依赖参考的数据库建设不够完善、核内DNA条形码[23]和混合物种样品单一条形码获取困难等不确定因素[24]；多重PCR联合酶联吸附法操作繁琐，成本较高；单物种PCR法检测速度较快，但是检测物种较少，每次只能检测一个物种，而且目前建立的单物种特异性PCR多集中在大西洋鳕鱼[25]、太平洋鳕鱼[26]、细鳞壮鳕[27]等鳕形目鳕鱼。开发满足行业快速检测蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的分子鉴定方法成为迫切需求。

本研究针对蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼和异鳞蛇鲭的市场检测需求，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲线法，开发同时检测蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭3 个物种的多重real-time PCR检测方法，以期实现多物种的快速检测，同时降低检测成本，能够满足多样品的快速检测需求，具有很好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

建立多重real-time PCR方法体系所用鱼类和畜禽肉：4 种金枪鱼、剑旗鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭由北京水产公司远洋捕捞队提供；燕鲅鱼、鲐鲅鱼、青鱼、草鱼、鳙鱼、鲢鱼各1 种，来源于北京岳各庄水产批发市场；猪肉采购于北京二商大红门肉类食品有限公司；牛、绵羊、山羊肉来源于北京月盛斋清真食品有限公司；鸡、鸭肉购于北京永辉超市。

1.1.2 试剂

动物组织基因组D N A 提取试剂盒 天根生物 （北京）技术有限公司；LightCycler®480 real-time PCR反应管、SYBR Green酶体系预混液 罗氏诊断产品（上海）有限公司；无水乙醇 北京化工集团；DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取试剂盒 凯杰企业管理 （上海）有限公司。

1.2 仪器与设备

多样品剪切均质匀浆仪 美国欧姆尼公司；ME104分析天平 梅特勒-托利多（北京）公司；Vortex-Genie2涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司；NanoDROP one超微量分光光度计 赛默飞世尔科技有限公司；RocheLight Cycler 480 PCR仪 罗氏诊断产品（上海）有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR仪 美国伯乐公司；Eppendorf Centrifuge 5417R离心机 艾本德中国有限公司；Cascada BIO超纯水系统 美国颇尔公司。

1.3 方法

1.3.1 样品的处理及基因组DNA的提取

将鱼去鳞片，畜禽肉去筋膜，取肌肉剪碎，准确称取3 g肉，加水12 mL，调整均质仪10 000 r/min匀质10 min，取1.5 mL离心管吸取150 μL匀浆液于其中，8 000 r/min离心1 min，去上清液，然后按照试剂盒说明书操作提取DNA，4 ℃保存备用。

1.3.2 目标物种的引物设计

在NCBI网站获取6 种金枪鱼、8 种鳕鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭、刺鳞蛇鲭等26 种鱼类线粒体DNA序列，利用Mega 7.1软件进行序列比对，选择序列差异大的区域利用软件Oligo 7.56设计特异性引物。设计的引物在NCBI网站通过BLAST程序进行扩增产物同源性及特异性比对，比较不同引物对扩增产物Tm值并选取扩增产物Tm值差异显著的引物用于实验。最终，蓝鳍金枪鱼的特异性引物设计在线粒体DNA的D-loop区，裸盖鱼的特异性引物设计在线粒体DNA的16S rRNA基因，异鳞蛇鲭的特异性引物设计在线粒体DNA的ND4L基因，所有引物由赛默飞世尔科技中国合成（表1）。

表1 目标物种的引物信息Table 1 Information about primers for target species used in this study

1.3.3 设计引物的特异性验证

利用提取的各物种基因组DNA作为模板，进行real-time PCR扩增。采用10 μL的PCR体系，其中SYBR Green酶体系预混液5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 2 μL，加无菌重蒸水补足至10 μL。 real-time PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸共计45 s，重复35 个循环；熔解峰图制作：95 ℃变性1 min，降温至70 ℃、1 min，之后均匀速率（0.02 ℃/s）升温至95 ℃，并连续采集各温度下的荧光值；然后，60 s内降温至40 ℃。以温度为横坐标，荧光值对温度的一阶负导数为纵坐标，制作熔解峰值图[28]。

1.3.4 多重real-time PCR体系建立

选取蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的特异性引物，首先优化退火温度、循环数等扩增条件，已往文献报道多重PCR扩增过程中各引物对存在相互竞争的关系，引物浓度对多重real-time PCR能否扩增目标物种起重要作用，在多重PCR体系中调配合适的引物浓度能够有效避免个别物种漏检情况的发生[29]，据此设计系列不同浓度梯度的引物组合体系，根据各组合系统所产生的峰图高度调整不同物种引物浓度，以出现平滑、基本等高且特异的峰值图为标准，选定最优组合体系。如表2所示，采用25 μL的PCR体系，其中SYBR Green酶体系预混液12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各4.2 μL（上下游引物为蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭特异性引物按比例混合组成），模板DNA 2 μL，加无菌重蒸水补足至25 μL。real-time PCR程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火和延伸共计45 s，重复35 个循环；熔解峰图制作：95 ℃变性1 min，降温至70 ℃保持1 min，之后均匀速率（0.02 ℃/s）升温至95 ℃，并连续采集各温度下的荧光值；然后，60 s内降温至40 ℃。以温度为横坐标，荧光值对温度的一阶负导数为纵坐标，制作熔解峰值图。

表2 引物配比及各组分添加量（总体积25 μL）Table 2 Ingridents and formulation of PCR reaction system (total volume 25 μL)

1.3.5 多重real-time PCR检测的灵敏度

将蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的DNA溶液梯度稀释，分别配制5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL DNA溶液，开展灵敏度检测；制备蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼与异鳞蛇鲭的肉粉，按比例混合分别配制成含蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的混合肉样，提取DNA开展相对检出限灵敏度检测。

1.3.6 多重real-time PCR体系实际应用效果验证

采购金枪鱼、鳕鱼的鲜品切片、切块以及罐头制品，购置金枪鱼鲜品13 份，裸盖鱼切块9 份，烤鳕鱼片8 份，金枪鱼罐头5 份，鳕鱼类罐头5 份。利用所建立的多重real-time PCR检测方法测定其蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭成分。

1.4 数据处理

实验重复3 次，每次做2 个平行。所有数据采用±s表示。

2 结果与分析

2.1 设计引物的特异性验证

分别使用蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的特异性引物对蓝鳍金枪鱼、黄鳍金枪鱼、马苏金枪鱼、大目金枪鱼、三文鱼、黄鱼、草鱼、鲢鱼、鳙鱼、鲤鱼、青鱼、异鳞蛇鲭、燕鲅鱼、鲐鲅鱼、剑旗鱼、猪、牛、绵羊、山羊、鸡、鸭的DNA（5 ng/μL）进行 real-time PCR扩增，结果显示3 对特异性引物只对各自阳性物种DNA产生特异性扩增，而对其他物种DNA无典型扩增曲线出现，表明蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的特异性引物具有很好特异性。将3 对引物混合后对22 个物种DNA进行多重real-time PCR检测验证，扩增结果见 图1，检测结果与单一引物检测结果相同，表明3 对引物在多物种扩增中也具有很好的特异性，不同物种源性成分的Tm值相差显著。扩增产物的GC含量和片段长度的差异是造成这种差异的主要因素，为利用多重real-time PCR熔解曲线分析法建立掺假检测方法提供理论基础。DNA的Tm大小与其均一性、GC含量及介质中的离子强度等因素有关，所以离子浓度固定的溶液中，短链DNA的Tm值受其浓度、片段长度和GC含量的影响[30]。而长片段DNA则在变性过程中主要发生局部解链，首先解链低GC含量的部分，通常40～100 bp被认定为一个熔解单元[31]。片段大小超过100 bp后，GC含量和溶液浓度是影响DNATm值的主要因素。另外，种内个体变异只会发生几个碱基的突变，相应造成Tm值的变化也较小（同物种内不同个体DNA的PCR扩增产物的Tm测定误差范围为0～0.3 ℃）。因此，基于熔解曲线分析法不需判定片段内碱基序列的变异，只考虑特异性引物是否设计在的种内保守区，相比PCR-RFLP、荧光探针法和DNA条形码技术，本方法的优点也在此处[32-34]。

多重real-time PCR方法检测物种源性成分的能力与其反应重数密切相关。real-time PCR反应重数越多，各引物对的相互竞争就越激烈，real-time PCR体系的检测能力越容易受到限制。目前，已报道的研究中real-time PCR重数在5 重及以下，因此，研究者为了利用尽量少的引物对同步检测尽可能多的物种源性成分，往往将特异性引物设计在属特异种保守的序列处，从而提高所开发方法的检测灵敏度和通量，本实验设计的异鳞蛇鲭引物采用此策略，使其能检测异鳞蛇鲭和刺鳞蛇鲭。引物特异性验证的结果见表3。

图1 real-time PCR体系的特异性Fig. 1 Specificity of the established real-time PCR system

表3 引物特异性验证结果Table 3 Statistical results of specificity verification of primers

2.2 多重real-time PCR特异性检测结果

配制蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的混合肉样（各物种源性成分含量比例相同，物种组合见表4）， 提取各样品D N A，以提取的D N A 为模板进行多重 real-time PCR扩增，并分析熔解曲线，再次验证所建多重real-time PCR体系的特异性，同时确定各物种成分熔解温度（Tm）分布范围。分析各样品熔解曲线图，结果如图2、3所示，所检样品的熔解曲线峰位置、峰个数均与样品的物种源性成分组成相对应，均没有非特异性峰出现的现象，进一步表明建立的多重real-time PCR体系具有很好的特异性。3 次重复实验并计算各物种源性成分的Tm值，计算结果见表4。实验并统计不同引物浓度体系、不同模板浓度中3 种鱼类的Tm值分布情况，由统计结果可知3 种鱼类源性成分的熔解温度分布段分别为蓝鳍金枪鱼源性成分Tm值（74.98±0.60）℃、裸盖鱼源性成分Tm值（78.65±0.71）℃、异鳞蛇鲭源性成分Tm值（82.38±0.25）℃，各物种源性成分的Tm值均有偏移，异鳞蛇鲭源性成分的Tm值漂移范围最小，为0.5 ℃，裸盖鱼源性成分的Tm值漂移范围最大，为1.42 ℃，整体看来各物种源性成分的Tm值偏移跨度较小，表明所建方法稳定性较好；各物种源性成分Tm值范围之间相互不交叉，因此，分析所检测样品熔解曲线，根据谱图中溶解峰数和温度范围（即峰的位置）能准确判定所检样品中含有的物种。

表4 混合鱼肉样品中各鱼类成分熔解温度值Table 4 Melting temperature values of fish components in mixed fish samples

图2 多重real-time PCR检测各混合样DNA的熔解曲线Fig. 2 Melting curves of DNA in mixed samples detected by multiplex real-time PCR

图3 所建real-time PCR体系检测3 种鱼类混合DNA的熔解曲线Fig. 3 Melting curves of mixed DNA of three fishes detected by real-time PCR

2.3 多重real-time PCR检测方法的灵敏度

以制备成5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL的蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的质量浓度梯度DNA样品和3 鱼类混合DNA溶液为模板，进行多重real-time PCR扩增及熔解曲线分析，测试多重real-time PCR的DNA浓度灵敏度；由图4A可知，蓝鳍金枪鱼各质量浓度梯度样品的Tm分别为（75.37±0）、（75.47±0.20）、（75.38±0.04）、（75.88±0.01）、（76.24±0.11）℃； 由图4 B 可知，裸盖鱼各浓度梯度样品的Tm分别为（78.45±0）、（78.47±0.01）、（78.64±0.01）、（79.20±0.08）、（79.27±0.01）℃；由图4C可知，异鳞蛇鲭各浓度梯度样品的Tm分别为（82.1±0.01）、（82.07±0.01）、（82.11±0.04）、（82.26±0.01）、（82.47±0.01）℃。三者的Tm值均在各自的温度范分布围内，由此可知采用本方法多重real-time PCR体系检测单物种DNA，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭成分的检出限均为0.001 ng。由图4D可知，采用本方法多重real-time PCR体系测定混合样DNA溶液，10 ng混合DNA为模板，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的Tm分别为（74.49±0.04）、（78.09±0.05）、82.23±0.02）℃， 1 ng混合DNA为模板，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的Tm分别为（74.90±0.04）、（78.46±0.05）、（82.30±0.02）℃，0.1 ng混合DNA为模板，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭的Tm分别为（75.61±0.01）、（79.0±0.02）、（82.46±0.01）℃，三者的Tm值均在各自的温度分布范围内，可知本方法检测多物种时，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭源性成分的检出限为0.1 ng。

以含蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的质量分数梯度混合样品的DNA为模板，开展多重real-time PCR扩增，并分析熔解曲线，测试所建多重real-time PCR体系的相对检出限，测试结果显示采用所建多重real-time PCR体系检测混合样品DNA，蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭源性成分的检出限分别为0.5%、1%、0.5%。

本研究开发的多重real-time PCR检测方法的检出限与周彤等[35]开发的多重real-time PCR检出肉制品中动物源性的检出限相当，均能做到多物种检出限0.1 ng。已有 文献[36]报道0.1 ng DNA的检出限能充分满足鱼制品掺假检测的需求。

图4 所建多重real-time PCR的灵敏度检测Fig. 4 Sensitivity evaluation of multiplex real-time PCR

2.4 多重real-time PCR体系实际应用效果验证

为检验所建方法在实际样品中的应用效果，并更进一步验证所建多重real-time PCR的准确性。用本方法对采集的市售金枪鱼切块、裸盖鱼切块、烤鳕鱼片、鳕鱼罐头类、金枪鱼罐头类样品进行检测，结果表明，Tm值在（74.98±0.60）℃范围内出现熔解峰（蓝鳍金枪鱼源性成分）的有4 份样品；Tm值在（78.65±0.71）℃范围内出现熔解峰（裸盖鱼源性成分）的有8 份样品；Tm值在（82.38±0.25） ℃范围内出现熔解峰（异鳞蛇鲭源性成分）的有6 份样品；3 个Tm值范围内均未出现熔解峰的样品22 份。

表5 市场采购水产品的检测结果Table 5 Results of detection of aduleration in commercial aquatic products

从样品分类及结果的统计分析（表5）可以看出，金枪鱼切块、裸盖鱼切块、烤鳕鱼片、金枪鱼罐头、鳕鱼罐头中均存在标签错误标识或者掺伪，错误标识或者掺伪率达22.5%，所有检测样品中烤鳕鱼片的掺伪或者标签错误标识率最高，高达37.5%。金枪鱼切块制品中有产品标识为白金枪鱼切块，而检测结果显示实际物种为异鳞蛇鲭；烤鳕鱼片和罐头类制品的掺假也多数采用鲶鱼、异鳞蛇鲭等其他廉价或相似鱼种冒充。以上结果证明所建方法在实际样品检验中具有很好应用效果，该多重real-time PCR体系用于实际水产品的快速鉴别准确有效。

3 结 论

本研究针对蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼和异鳞蛇鲭的市场检测需求，基于3 种鱼类的线粒体基因序列，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲线法开发了同时检测蓝鳍金枪鱼、裸盖鱼、异鳞蛇鲭3 个物种的多重real-time PCR检测方法。该方法实现了多物种的快速检测，同时降低检测成本，能够满足多样品的快速检测需求。所建的多重real-time PCR检测方法具有很高灵敏度和很好的识别度，在实际水产样品的检测中也显示了不错的应用效果。所建方法能为监管机构快速检测水产类制品的物种提供技术支持，检测结果准确可靠，可供执法部门作为参考依据，同时提高市场监管部门打击水产制品掺假的效率，使其能够有效加强水产品的监管，保护消费者的健康，保证相关企业与消费者经济不受损；此外，所建方法为渔业正确识别所捕捞鱼类物种提供技术支持，从而改善目前金枪鱼、鳕鱼市场真实产品物种与标识物种不符的乱象，因此，所建方法会有很好的应用前景。