康 娇，张亚蓉，杨从绪，薛桥丽，胡永金,

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学学报编辑部，云南 昆明 650201）

云南传统泡菜发酵加工工艺简单，受发酵速度、品质等方面受自然条件的影响大，且泡菜菌种和产品不稳定、亚硝酸盐含量高等诸多问题严重的制约着云南泡菜的发展。Pederson等[1]在1961年第一次把纯种发酵技术应用于泡菜的生产研究中。国内对直投式发酵剂到20世纪90年代才开始进行，到目前为止商业化生产发酵剂的公司还比较少，很多企业还只能依靠进口购买发酵剂，因此发酵剂市场大部分依然被国外制备发酵剂的公司所占据[2-3]。

直投式乳酸菌发酵剂是采用优质乳酸菌进行液体高密度培养后，经过菌体细胞分离，与保护剂介质混溶制备高浓度菌悬液，再经冷冻干燥、无菌包装后制成的一系列高浓度和标准化的发酵剂菌种[4]，具有活力高、接种量少、可直接应用于生产等特点[5]。直投式乳酸菌发酵剂是目前发酵工业的一个研究热点[6]。乳酸菌发酵剂的制备方法常使用真空冷冻干燥[7]，为降低冷冻干燥过程中细胞的死亡率，利用冻干保护剂可对细胞起到一定的保护 作用[8-9]，在冻干过程中，减轻或防止冷冻干燥时对菌体细胞物理、化学损伤或复水时对细胞的损害，保持原有的多种生物活性和各种理化特性，从而提高菌体存活率[10-11]。

从云南富源泡菜中分离得到的发酵乳杆菌FYa1，具有较高胞外多糖产量（约为175 mg/L），而许多胞外多糖都具有抗肿瘤[12-13]、抗氧化[14-16]、免疫调节[17-19]、降胆 固醇[20-21]、降血压[22]、增强黏膜吸附作用[23]等生物活性。本研究旨在开发生长速度快、发酵活力高、发酵风味好、亚硝酸盐降解能力强的泡菜优良发酵剂，为云南传统泡菜科学加工和产品质量提升提供一定科学理论和应用依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）FYa1分离于云南富源酸菜，4 ℃斜面保存。

1.1.2 试剂

脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠、谷氨酸、甘油、甘露醇（均为分析纯） 天津市风船化学试剂科技有限公司；平板计数培养基、MRS肉汤培养基 广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TGL 20M型冷冻离心机 湖南湘立科学仪器有限公司； FD-1A-50冷冻干燥机 上海比郎仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 直投式泡菜发酵剂的工艺流程及操作要点

1）菌种活化：分离纯化得到的优势菌株接种到MRS液体培养基中，37 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h，连续活化2 次，得活化菌种。

2）菌种扩大培养：将活化的菌种按3%的接种量接种至优化的MRS液体培养基中，37 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养48 h。

3）离心收集菌泥：选择适合的离心条件，尽量降低离心损失率和冷冻干燥时造成的细胞死亡率。以离心转速、时间和温度为参数，取发酵液至已灭菌的离心管中，离心后，弃上清液收集菌泥。加入等体积无菌生理盐水打散混匀后，做梯度稀释，选取适合浓度梯度，采用平板计数法测定FYa1活菌数。

4）菌悬液的制备：将冻干保护剂溶解制成相应浓度的溶液，121 ℃灭菌15 min备用。发酵液离心后弃去上清液，菌泥中分别加入配制灭菌后的保护剂，保护剂添加量为离心前菌液体积的1/10，混合均匀。菌悬液配制好后采用梯度稀释平板法进行活菌计数。

5）预冷冻：在真空冷冻干燥菌种的过程中，微生物存活率与冻结速度有极其重要的关系。为提高乳酸菌对低温环境的适应能力，将制备好的菌悬液放入-80 ℃冷冻室4 h[24]，进行预冷冻，使其冻结均匀。

6）真空冷冻干燥：待菌悬液冻结完全后，迅速取出转移至真空冷冻干燥机内，开启真空泵，直至形成干燥菌粉。冻干条件为真空度9.7 Pa、冷阱温度-50 ℃，冻干时间约18 h。冻干后取干燥菌粉测定活菌总数，计算冻干存活率。

7）活菌计数：冻干后的菌粉，加入与保护剂相同体积无菌水溶解，采用梯度稀释法，选择合适的稀释度，在37 ℃下恒温培养48 h，进行活菌计数。

1.3.2 直投式泡菜发酵剂离心条件的筛选

采用单因素配合正交试验，以FYa1离心存活率作为测量指标，优化发酵剂的离心条件。

1.3.2.1 单因素试验

考察离心转速（2 000、4 000、6 000、8 000 r/min）对FYa1存活率的影响时，固定离心温度4 ℃、离心时间10 min。选取离心存活率较高转速，在一定离心温度（4、10、15、20、25 ℃）下，离心10 min。在之前实验的基础上，选取离心存活率较高转速和离心温度，比较在不同离心时间（10、20、30、40 min）下，FYa1的离心存活率。计算不同离心条件下FYa1的离心存活率。

1.3.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，采用L9（34)正交试验，对离心转速、离心温度、离心时间进行优化，确定FYa1的最佳离心条件。正交因素与水平设计见表1。

表1 发酵剂离心条件正交试验因素与水平Table 1 Level and code of independent variables used for orthogonal array design

1.3.3 直投式泡菜发酵剂冷冻干燥保护剂的复配优化

1.3.3.1 Plackett-Burman试验

Plackett-Burman试验设计用于Box-Behnken试验前挑选优化因素。结合参考文献[25-26]对影响乳酸菌冷冻干燥存活率的相关因素，对脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠、谷氨酸、甘油、甘露醇进行初步考察，检测冻干存活率。因素与水平设计见表2。

表2 发酵剂冷冻干燥保护剂水平Table 2 Code and level of independent variables used for Plackett-Burman design%

1.3.3.2 Box-Behnken设计优化最佳保护剂配方

根据Plackett-Burman试验设计的结果，从中选取海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠用量为影响冻干存活率的3 个主要因素，以冻干存活率作为响应值（Y），设计Box-Behnken试验，确定最佳冻干保护剂的配方。试验因素及水平设计见表3。

表3 Box-Behnken试验因素与水平Table 3 Code and level of independent variables used for Box-Behnken design g/100 mL

1.3.4 直投式泡菜发酵剂的发酵性能检测

为探究直投式泡菜发酵剂在实际发酵中的发酵活性，将优化后所得直投式发酵剂接种到萝卜泡菜中进行发酵。

1.3.4.1 泡菜制备

以萝卜为原料，均匀切成边长2 cm正方体形，开水漂烫1 min，沥水备用。将处理好的萝卜以1 kg每瓶分装于泡菜瓶中，按料液比1∶1（kg/L）加入水，添加质量分数0.03%直投式泡菜发酵剂（添加前温水复活30 min），37 ℃发酵，取前中后末期样品各1 次，直至发酵终点。测定泡菜发酵过程中微生物指标（菌落总数、霉菌、酵母、乳酸菌及致病菌）。

1.3.4.2 微生物指标测定

菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检测 菌落总数测定标准》[27]；霉菌和酵母总数的测定采用平板计数法，参照GB 4789.15—2016《食品微生物学检测 霉菌和酵母菌计数标准》[28]；大肠菌群参照GB 4789.3—2010《食品微生物学检测 大肠菌群计数》[29]；乳酸菌参照GB 4789.35—2016《食品微生物学检测 乳酸菌总数测定标准》[30]。

1.4 数据分析

使用SPSS 18.0、Minitab 17进行试验设计与统计分析；采用Origin制作图表。

2 结果与分析

2.1 直投式泡菜发酵剂离心条件的筛选

2.1.1 单因素试验结果

图1 离心转速（A）、离心温度（B）以及离心时间（C）对 FYa1存活率的影响Fig. 1 Effects of centrifugation speed (A), temperature (B) and time (C) on survival rate of FYa1

由图1可知，FYa1存活率随转速的升高，呈先上升后下降的趋势，在4 000 r/min时存活率达到峰值，后离心存活率持续下降。离心存活率随着离心温度的升高总体呈下降趋势，存活率在4～15 ℃时处于较高水平。随着离心时间的延长离心存活率总体呈下降趋势，离心达40 min时，有小幅上升现象，但幅度不大。故综合考量，选取转速4 000 r/min、离心温度4～15 ℃、离心时间10 min进行后续正交试验，优化离心条件。

2.1.2 正交试验优化发酵剂离心条件

离心转速、离心时间、离心温度极差分别为4.754、20.037、7.620，极差越大表明该因素对FYa1离心存活率的影响越显著，因此离心条件对菌株的离心存活率的影响的主次顺序依次为：离心时间＞离心温度＞离心转速。由k值 可知，离心条件各因素的最佳组合为A1B3C3，即离心转速3 000 r/min、离心时间15 min、离心温度15 ℃，在这个条件下，FYa1离心存活率达到了34.57%（表4）。

表4 发酵剂离心条件正交试验设计及结果Table 4 Orthogonal array design with experimental results for optimization of centrifugation conditions

2.2 直投式泡菜发酵剂冷冻干燥保护剂的复配优化

2.2.1 Plackett-Burman试验结果

表5 Plackett-Burman试验设计及结果Fig. 5 Plackett-Burman design with experimental results

通过Plackett-Burman试验设计，对脱脂乳粉、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、谷氨酸钠、谷氨酸、甘油、甘露醇8 种冻干保护剂进行初步考察，筛选出对FYa1冻干存活率影响较显著的因素，试验设计及FYa1冻干存活率响应值结果见表5。FYa1冻干存活率在38.7%～62.3%之间，经方差分析后，可分析各干燥剂对FYa1冻干存活率的影响，从而筛选出主要影响因素。

表6 Plackett-Burman试验结果方差分析Table 6 Analysis of variance of Plackett-Burman design results

从表6可知，除葡萄糖、谷氨酸和甘露醇对FYa1冻干存活率的影响为负效应外，其他均表现为正效应，并且海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠3 个因素的效应值最大，且P值均小于0.05，表明海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠对FYa1冻干存活率影响显著，其他因素则没有显著性差异。

图2 标准化效应Pareto图Fig. 2 Pareto chart of the standardized effect

由图2可知，各因素对FYa1的冻干存活率影响显著程度依次为：海藻糖＞蔗糖＞谷氨酸钠＞葡萄糖＞甘油＞谷氨酸＞脱脂乳粉＞甘露醇。其中，海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠对响应值影响显著（P＜0.05），是决定FYa1冻干存活率的重要因素。因此选择海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠作为主要影响因素，进行进一步的Box-Behnken响应面设计，优化复配冷冻干燥保护剂。

2.2.2 Box-Behnken设计优化最佳保护剂配方

根据Plackett-Burman试验设计结果，进一步用Box-Behnken响应面法优化冻干保护剂的配方，以FYa1冻干存活率（Y）为响应值，试验设计与结果如表7所示。

表7 冻干保护剂Box-Behnken响应面试验设计及结果Table 7 Box-Behnken design with experimental results

采用Minitab17软件对数据进行二次多项回归拟合，获得FYa1冻干存活率的二次回归拟合多项式方程为：Y对回归方程进行方差分析，结果见表8。

表8 响应面方差分析结果Table 8 Analysis of variance of Box-Behnken design results

该模型显著（P=0.005 7＜0.01），失拟不显著（P=0.491 3＞0.05），模型的F值为13.02，该模型的R2为0.959 1、R2Adj为0.885 4表明试验所采用的模型拟合程度良好，在统计学上有意义。各因素中、、对响应值冻干存活率影响极显著（P＜0.01），其余因素对冻干存活率影响并不显著（P＞0.05）。各因素与响应值冻干存活率之间的关系可以通过回归方程描述，可以利用该模型预测冻干保护剂的配方和菌体冻干存活率。海藻糖、蔗糖和谷氨酸钠对FYa1冻干存活率影响的等高线和响应面如图3所示。

图3 各因素交互作用下FYa1冻干存活率的等高线和响应面图Fig. 3 Contour and response surface plots showing the interactive effects of trehalose, sucrose and sodium glutamate on the survival rate of lyophilized FYa1

分析回归方程Y，得到8.5 g/1 00 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/100mL谷氨酸钠时的最大响应值。通过验证实验验证模型方程预测最优响应值的适用性。冻干菌粉的存活率为（68.53±0.09）%，此时测得FYa1发酵剂的含菌量为（2.0±0.05）×108CFU/g。

2.3 直投式泡菜发酵剂的发酵性能

FYa1发酵剂及老汤发酵的泡菜，发酵过程各微生物指标测定结果如表9所示。FYa1发酵剂泡菜的菌落总数在第0小时为2.8×105CFU/mL，随时间的延长泡菜中细菌迅速增殖，10 h菌落总数略微下降，之后趋于平稳。乳酸菌数在第0小时为9.7×104CFU/mL，经过5 h发酵后，发酵剂泡菜中乳酸菌数增加至6.7×108CFU/mL，之后基本趋于稳定。酵母菌数随发酵进行不断减少，10 h后直至发酵结束都未被检测出。发酵过程中均未检测出霉菌与大肠菌群。

表9 微生物指标变化Table 9 Changes in microbial populations in the DVS during pickle fermentation

综合分析，虽然发酵前期FYa1发酵剂泡菜中菌落总数与酵母菌数较少，但随着发酵进行，FYa1迅速成为优势菌群，累积乳酸降低发酵环境中的酸度，从而抑制其他杂菌，比如酵母菌的生长，故第10小时未检测出酵母菌以至于菌落总数出现略微降低。这证明FYa1发酵剂具有优秀的发酵性能，在发酵过程中展现出良好的复活能力。

3 结 论

FYa1直投式泡菜发酵剂的最佳离心条件为离心转速3 000 r/min、离心时间15 min、离心温度15 ℃，在此条件下，FYa1离心存活率达到了34.57%。冻干保护剂的最佳配比为8.5 g/100 mL海藻糖、8.5 g/100 mL蔗糖和2.5 g/m L 谷氨酸钠，冻干菌粉的存活率为（68.53±0.09）%，此时测得FYa1直投式泡菜发酵剂的含菌量为（2.0±0.05）×108CFU/g。FYa1直投式泡菜发酵剂具有优秀的发酵性能，在发酵过程中展现出良好的复活能力。