周慧敏，赵 冰，吴倩蓉，李 素，潘晓倩，朱 宁，乔晓玲，王守伟，刘博文，张顺亮

（中国肉类食品综合研究中心，肉类加工技术北京市重点实验室，北京 100068）

腊肠属于我国传统腌腊肉制品，黑白胡椒是一种常用的调味品，一般黑胡椒的味道比白胡椒浓烈，白胡椒的味道更加柔和、清香，且香味比较稳定，不易散失；而白胡椒辛辣味更甚，所以驱寒效果更佳，调味效果稍差，常常配伍使用可达到风味和食疗功效最佳的效果，因此黑白胡椒风味的腊肠广泛受到消费者的喜爱。腊肠由于其水分活度低和防腐剂、色素、调味料、抗氧化剂的使用，一般拥有长达6～10 个月的货架期。腊肠若贮藏不当会缩短货架期，主要受氧化现象引起的感官恶化影响，因为致病菌或腐败菌很难在腊肠中繁殖[1-3]。风味是评价其品质的重要指标之一，也是消费者购买时所参考的重要因素，还可预测产品的货架期。研究认为，随着贮藏时间的延长，腌腊肉制品的风味会逐渐发生变化，从而导致可接受性的丧失。在贮藏期中风味的劣变一般早于其他感官品质的变化[4-5]。酸败和哈喇味是其风味恶化的主要原因，而其他可能形成的异味，如霉味、金属味、腐臭味或辛辣味，是导致食用品质丧失的次要原因[6-7]。

风味恶化的原因较复杂，一方面是由于导致异味的风味化合物的形成或浓度增加，另一方面是由于腌制液、胡椒和其他香辛料、调味料等赋予的香味化合物的降解或逸失。通过监测挥发性风味物质的变化可以解析腊肠在贮存期间气味的改变[8-10]。同时贮藏期间发生的理化反应（氨基酸的Strecker降解、美拉德反应、脂肪水解氧化等）也可以通过检测挥发性风味物质指示。在众多品种的腊肠中基本包括醛类、酮类、醇类、酯类、烷烃和萜烯等挥发性化合物[1]。根据其可能的来源分为香料（萜烯类和脂肪族硫化合物）、脂质氧化（醛类、烃类、醇类和酮类）、微生物酯化和料酒（如乙酸丙酯、丙酸乙酯和己酸乙酯）、碳水化合物发酵（如1,3-丁二醇和苯乙醛）、氨基酸分解代谢（如2-甲基丁醛、2-甲基-1-丁醇和2,3-丁二醇）、其他来源以及这些因素之间的交互反应[11-13]。而干腌肠贮藏中出现的酸败与脂质氧化过程中醛、酮和羧酸的形成有关，在较小程度上与游离氨基酸，如赖氨酸、酪氨酸或天冬氨酸的产生有关。

国内针对腊肠的品质保持研究已有较多报道，如添加天然抗氧化剂、香辛料、调味料、发酵剂等及包装、贮藏温度的筛选[2,14-18]。且对不同类型腊肠中挥发性风味物质进行分析，如唐玲[19]检测广式腊肠中的挥发性风味物质主要为乙醇和短链乙酯类，占总挥发性物质的80%左右。宋永等[20]检测哈尔滨风干肠中最主要的风味化合物为己酸乙酯，其次为乙醇、己醛和丁酸乙酯。张大革等[21]检测传统发酵干香肠中主要挥发性风味物质为酯类占42.07%、醛类占31.22%。不同种类的腊肠主体挥发性风味物质之间存在一定差异，并不是所有风味物质对产品整体风味有贡献，气味活性化合物的确定是食品风味研究的热点和重点。另外目前针对风干肠、广式香肠风味劣变的原因也有一些报道，研究认为脂肪过度氧化产生较多的醛、酮类物质，对腊肠风味造成负面 影响[12,18-19]；吴倩荣等[22]检测风干肠中挥发性风味物质主要为酯类物质，经气味活性值（odour activity value，OAV）分析以及气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）鉴定，辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛可能是造成风干肠异味的主要物质。但针对黑白胡椒腊肠在贮藏过程中气味活性物质演变规律、异味解析及货架期评价的相关研究鲜见报道。

本研究通过采用吹扫捕集-热脱附-气相色谱-嗅闻-质谱（purge & trap-thermal desorption-gas chromatographyolfactometry-mass spectrometry，P&T-TDS-GC-O-MS）联用对不同贮藏时间的黑白胡椒腊肠样品中的挥发性风味物质进行定性定量分析，结合OAV、感官评价和相关性分析，研究贮藏过程中黑白胡椒腊肠的气味活性化合物的演变规律，以及解析异味的主要贡献物质，并对其结果进行主成分分析（principal components analysis，PCA）和二维聚类热图分析，建立风味劣变和货架期预测的有效评价手段，以期为腊肠风味保持和异味控制技术的开发提供支持，为优化其贮藏条件及提高风味品质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪4号肉、猪背脂 北京中瑞食品有限公司；腊肠辅料 北京美添前景科技有限公司；2-甲基-3-庚酮标准品、C8～C20正构烷烃 美国Sigma公司；C10～C25正构烷烃 上海安普实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

0SCAR 20型灌肠机 德国海因里希弗雷机械制造有限公司；BYXX-50烟熏炉 中国艾博有限公司；Gerstel TDS-3半自动热脱附进样器、TC-200型多吸附管老化仪、Tenax-TA吸附管、嗅闻仪 德国Gerstel 公司；吹扫捕集制样瓶 自制；TRACE1310-TSQ8000 GC-MS联用仪、TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美国赛默飞世尔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 腊肠制作和取样

产品配方：原料（4号肉∶背脂=4∶1）；配料（根据原料质量按比例添加）：亚硝酸钠0.003%、盐2%、白砂糖1%、葡萄糖0.5%、味精0.1%、白胡椒0.1%、黑胡椒0.15%、异抗坏血酸钠0.15%、冰水10%。

工艺流程：分别将剔除筋膜的猪瘦肉和背脂切块，通过8 mm孔板的绞肉机绞碎→按比例添加配料和原料搅拌→灌肠（胶原蛋白肠衣，23 mm）→打结（10 cm）→风干（45 ℃，48 h）→冷却→包装（常压密封包装）→后熟7 d（常温）→成品→贮藏。

取样：将黑白胡椒腊肠成品在37 ℃干燥箱中贮藏，分别在贮藏的第0、7、21、35、49、77天，共6 个点取样。黑白胡椒腊肠在贮藏第77天的样品颜色变黑，腊味香味丧失，异味非常强烈，完全不可接受，故贮藏至77 d后停止实验；挑战性贮藏（37 ℃有氧条件）是为了加速腊肠的氧化变质，以解析异味的主要风味化合物[22]。

1.3.2 P&T提取挥发性风味物质

在室温条件下将腊肠用破壁机切碎混匀，准确称取10 g样品置于样品瓶中，加入1 µL 2-甲基-3-庚酮标准品（0.816 µg/µL）作为内标物，旋紧瓶盖，55 ℃平衡10 min；样品瓶的一端通氮气，吹扫流速为50 mL/min，另一端用已老化的TA吸附管富集腊肠的挥发性风味化合物，55 ℃吸附40 min后，取出吸附管用氮气反吹10 min去除水分，之后在热脱附进样口进样，每个样品平行测定3 次取平均值[23]。

1.3.3 TDS-GC-MS测定挥发性风味物质程序[24]

T D S 程序：采用标准加热模式，氦气流速 20 mL/min，不分流；升温程序：初始温度40 ℃，保持0.1 min；以40 ℃/min上升到210 ℃，保持5 min；传输线温度215 ℃。

冷进样条件：采用标准加热模式；液氮冷却；升温程序：初始温度-100 ℃，平衡0.1 min；以10 ℃/min升到215 ℃，保持5 min；分流比为30∶1。

GC条件：TG-Wax MS极性柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）提前净化；高纯氦气（纯度＞99.99%）为载气；流速1.5 mL/min；不分流进样模式，保持1 min。升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min速率升温至200 ℃，8 ℃/min速率升温至230 ℃，保持3 min。

MS条件：电子电离源，温度280 ℃；传输线温度230 ℃；电子能量70 eV；全扫描模式：质量扫描范围 m/z 40～600。

1.3.4 嗅闻检测[13,22]

挥发性风味混合物经GC分离后通过三通器分别进入质谱检测器和嗅闻检测器，分流比为1∶1，嗅闻传输线温度为200 ℃。选取3 名嗅觉灵敏，并经过专业培训的人员在嗅闻口进行嗅闻，记录所闻到的气味保留时间、气味特征以及气味强度。强度分为5 个等级（1=气味非常微弱、2=气味微弱、3=气味中等、4=气味强烈、5=气味非常强烈）。每种风味化合物的气味描述以及时间须由至少2 名评价员确认一致，则将该描述记为最终实验结果。

1.3.5 挥发性风味物质分析

定性分析[22]：将色谱图中的化合物与NIST、Wiley等数据库进行比对，化合物的确定以正匹配和反匹配均大于700为准。并且利用系列正够烷烃在相同升温条件下的保留时间计算待测化合物的保留指数（retention index，RI），与文献值[25]进行比对，结合嗅闻结果对贮藏期的腊肠中挥发性风味物质进行定性分析。

定量分析：根据化合物峰面积与含量的比值为定值，计算每一种风味化合物相对于内标物的含量，按式（1）计算未知挥发性化合物含量：

其中：CX为未知挥发性化合物含量/（µg/kg）；AX为未知挥发性化合物的峰面积/（AU·min）；C0为内标的质量浓度/（μg/µL）；A0为内标的峰面积/（AU·min）；V为内标的加样量/µL；m为样品的质量/g。

1.3.6 OAV的计算

采用OAV评价各化合物对样品总体风味的贡献[26]；风味阈值通过查阅文献[27]，按式（2）计算OAV：式中：C为挥发性化合物含量/（µg/kg）；T为该物质在水中的察觉阈值/（µg/kg）。

1.3.7 感官分析

对不同贮藏时间点的黑白胡椒腊肠进行定量描述感官评价，参照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定规范》[28]的要求，制定感官评价标准，选取10 名经过专业培训的感官评价员，将腊肠切成2 mm左右厚的薄片，感官评价实行10 分制原则，总分为30 分，评分标准 如表1所示。

表1 感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation of Chinese sausage

1.4 数据处理

采用Excel对平均值、标准差、RI等数值进行计算以及绘图；利用SPSS 21.0对原始数据进行Duncan单因素显著性差异分析以及Pearson相关性分析。采用UnscrambX 10.1软件对不同贮藏时间腊肠样品组中风味活性化合物（OAV≥1）进行PCA。再利用Heatmapper网络在线软件对不同贮藏时间腊肠样品组和风味活性化合物（OAV≥1）基于欧氏距离采用平均连接法同时进行二维聚类分析，并绘制热图。

2 结果与分析

2.1 贮藏时间对黑白胡椒腊肠感官评价的影响

表2 不同贮藏时间黑白胡椒腊肠感官评分Table 2 Sensory evaluation results of Chinese sausages added with black and white pepper at different times of storage

由表2可知，样品的色泽和整体接受度得分在贮藏前7 d无显著变化，之后随着贮藏时间的延长均显著下降（P＜0.05）。 腊肠的色泽逐渐从亮红色（成品和贮藏7 d） 到暗红色（贮藏21 d），褐色（35～49 d），最终为黑色（77 d），这是由于贮藏过程中亚硝基肌红蛋白逐渐被氧化造成的，这与吴倩蓉等[22]的实验结果相似。腊肠的风味得分在贮藏的前7 d略有增加，之后逐渐降低。这可能是由于贮藏前期脂肪水解氧化、氨基酸降解和微生物代谢等继续产生腊肠的特征化合物，因此在贮藏第7天腊味更加浓郁。而之后腊香味和胡椒味逐渐减弱（21 d），略有异味（35 d），最终异味强烈和酸败味明显（49～77 d）。风味劣变，产生异味、哈败味，可能来源于脂肪氧化变质、氨基酸过度降解，因为低浓度时具有正向风味贡献的化合物在高浓度时可能变成异味。腊肠整体接受度得分与色泽、风味相一致，在贮藏的前7 d样品有较高评分，其色泽、风味均处于最佳状态，随着贮藏时间的延长缓慢降低，而在贮藏第35天时色泽变褐，出现异味，为品质劣变的临界点，表明到达货架期的终点，之后产品劣变程度加速，变得不可接受。

2.2 黑白胡椒腊肠在贮藏过程中风味活性物质的演变规律

采用P&T-TDS-GC-MS联合技术和RI比对检测不同贮藏时间的黑白胡椒腊肠中挥发性风味物质，共鉴定出106 种挥发性风味物质，但其对产品总体风味特征的贡献度是由风味体系中挥发性物质的浓度与感觉阈值共同决定的。一般认为，OAV≥1的挥发性风味物质为样品的风味活性化合物，对整体风味有直接影响，且OAV越大该化合物对整体气味的贡献就越大。 0.1≤OAV＜1的组分被认为对样品的总体风味具有重要的修饰作用[26,28]。因此进一步计算全部挥发性风味物质的OAV，得到56 种OAV≥0.1的化合物，如表3所示，醛类（15 种）最多，其次为烯烃类（9 种）、酯类（8 种）、酮类（7 种）、醇类（6 种）、其他杂环类物质（6 种）和酸类（5 种）。在不同贮藏时间6 组样品中检出OAV≥0.1的风味物质分别为37、39、38、39、40、40 种，说明贮藏前期挥发性化合物（OAV≥0.1）种类持续增加，中期保持稳定。由图1可知，OAV总和分别为2 008.93、2 507.20、2 982.08、3 958.29、4 675.89、5 474.35。随着贮藏时间的延长，风味物质的OAV总和逐渐增加，与成品比较（贮藏0 d），前21 d贮藏期的样品总OAV增加不显著，但在贮藏第35天时，总OAV增加显著。其中醛类物质OAV占比最高，占85.85%～90.35%。除酯类和烯烃类物质，各类风味物质的OAV随着贮藏时间的延长，均持续增加，与成品比较，尤其在贮藏35～49 d之间增加最显著。而酯类的OAV在贮藏第14天出现了最低点，在其他贮藏时间点OAV持续增加。烯烃类在整个贮藏过程中OAV基本稳定。

表3 黑白胡椒腊肠在贮藏过程中气味活性化合物的OAVTable 3 OAVs of various odor-active compounds in Chinese sausages added with black and white pepper during storage

续表3

图1 各类气味活性物质不同贮藏时间的OAV（A）和 OAV在不同贮藏时间的占比（B）Fig. 1 Actual (A) and percent (B) OAVs of various classes of odoractive compounds at different storage time points

2.2.1 风味活性醛类物质

由表3可知，黑白胡椒腊肠成品中风味活性醛类物质的OAV最高，达1 724.58，对成品整体风味贡献率高达85.85%，其中主要是源于脂肪氧化的直链醛类，占98.76%，被认为是影响样品整体风味的主要贡献物。直链醛包括直链饱和醛（戊醛、己醛、庚醛等）、2-直链烯醛（顺-2-庚烯醛）和2,4-直链二烯醛（2,4-壬二烯醛醛）。如图2所示，直链饱和醛和2-直链烯醛在贮藏过程中持续增加，在贮藏末期（77 d）时其OAV分别是成品的4.75 倍和3.57 倍，而2,4-直链二烯醛的OAV在贮藏的前35 d持续增加近1 倍，之后趋于平缓，这主要由 反,反-2,4-癸二烯醛所主导，在肉制品中赋予油炸味。根据OAV的大小，醛类物质中对成品风味贡献度最大的为反,反-2,4-癸二烯醛（1 005.25），其次是己醛（388.07）、庚醛（110.15）、反,反-2,4-壬二烯醛（65.02）、反-2-辛烯醛（63.99）、壬醛（48.73）等。

直链饱和醛，如戊醛具有辛辣味，己醛具有青草味，庚醛具有脂肪味，壬醛和辛醛具有油脂气味、清新味。这些饱和醛在贮藏过程中显著增加，在贮藏第77天样品OAV是成品的3～7 倍。反-2-辛烯醛和反-2-癸烯醛赋予样品坚果味、牛油味，这2 种对风味贡献较大的2-直链烯醛在贮藏过程中也显著增加，在贮藏第77天OAV是成品的3～4 倍。这些醛类物质浓度较小时，具备清香、脂肪的气味，对成品的香气起积极的作用；浓度较大时，则会变成异味。文献[29-31,11-12]研究报道，庚醛、辛醛、壬醛来源于油酸的自动氧化；己醛、反-2-辛烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛是亚油酸自动氧化的主要产物，戊醛是13-亚油酸过氧化氢的热解产物；其他醛类如反-2-辛醛、反-2-癸烯醛和反,反-2,4-壬二烯醛也来源于其他脂类的氧化。说明脂肪氧化反应对产品的异味具有很大的贡献作用。

其他少量的非脂肪族醛类，如2-甲基丁醛、苯甲醛、苯乙醛、4-乙基苯甲醛，源于支链氨基酸和苯丙氨酸的Strecker降解或微生物代谢[11]，主要贡献巧克力、杏仁和焦糖味。除4-乙基苯甲醛，其他的氨基酸代谢醛类均在成品中检到，且随着贮藏期的延长呈现增加的趋势，尤其是2-甲基丁醛和苯乙醛在贮藏后期（35 d后）增加显著，OAV达到50左右。说明在贮藏过程中氨基酸代谢反应对产品后期异味的生成有一定贡献。

图2 各类直链醛类OAV在不同贮藏时间的变化Fig. 2 Changes in OAVs of various straight-chain aldehydes at different storage time points

2.2.2 风味活性醇类物质

黑白胡椒腊肠成品中醇类物质的OAV占比次高，为169.72，对成品整体风味贡献率为8.45%，样品在贮藏过程中分别检出4、3、5、5、5、3 种风味活性醇类化合物，除了芳樟醇，其他大部分均为源于脂肪氧化的正构醇。其中对风味贡献较大的为芳樟醇（154.97）和1-辛烯-3-醇（13.04）。具有薰衣草香的芳樟醇经常在黑白胡椒的挥发性气味中被发现[32]，在贮藏过程中增加不显著（P＞0.05）。而具有蘑菇气味的1-辛烯-3-醇被普遍认为是花生四烯酸中12-过氧化氢的氧化产物[29]，在贮藏过程中显著增加（P＜0.05），贮藏的第77天OAV为111.55，增幅达到7.5 倍，是异味产生的主要因子。这与其他 研究[22,33]结果相似，但在半发酵香肠中未检到[34-35]。

2.2.3 风味活性酯类物质

虽然黑白胡椒风干肠成品中酯类物质含量较低，但由于其风味阈值较低，因此对成品整体风味有一定贡献，为3.58%。样品在贮藏过程中分别检出5、6、6、6、5、7 种风味活性酯类化合物，多为C2～C10羧酸乙酯类和内酯类。一方面可能源自脂肪氧化产生的羧酸与醇，或与微生物代谢产生的小分子酸、醇发生酯化反应，另一方面脂肪水解产生的游离脂肪酸可能发生酯化反应或是羟基脂肪酸水解后生成羟基酸，经过加热脱水、环化生成内酯，酯类物质赋予风干肠水果香气[25]。随着贮藏时间的延长，酯类物质OAV呈现先减少，21 d后呈现增加的趋势，这主要由OAV最高的异戊酸乙酯主导。在加工后期酯类物质的增加可以掩盖异味。酯类物质在贮藏过程中的变化趋势与其他研究者[22]的研究结果相似，但酯类物质对产品的贡献度差别很大，这主要由于产品制作配料的差异。Lorenzo等[35]在半干发酵香肠中检测到的酯类物质为甲酯类，且随着贮藏时间的延长而逐渐减少。

2.2.4 风味活性酮类和酸类物质

酮类和酸类对成品整体风味贡献率分别为0.63%和0.30%，在贮藏过程中显著增加2～4 倍（P＜0.05）。不同样品组中，分别检测到酮类物质3、4、4、5、4、4 种，主要是2-庚酮、3-羟基-2-丁酮，在大部分腌腊制品中均为特征性风味化合物。酮类化合物可能是由多不饱和脂肪酸的热氧化或降解产生的[29,33]。烯酮有一种甜味和水果味，如甲基庚烯酮在贮藏中后期未检出。而二酮通常有肉和奶油味[29,36]，如2,3-戊二酮在贮藏后期检测到。 3-羟基-2-丁酮存在于烤烟叶、奶油、可可、水果中，有令人愉快的奶油香味，仅在成品中检到。值得注意的是，贮藏过程中显著增加的是甲基酮、2-庚酮和2-壬酮，具有肥皂、干酪味，可能是异味的贡献者。有研究报道，不饱和脂肪酸，亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸氧化生成己醛、戊醛、辛醛、壬醛等直链醛，还有甲基酮[32]。

中链偶数脂肪酸被认为是奶酪风味的直接因素，因为它们的感知阈值很低。长链游离脂肪酸（大于12的碳原子）对风味的贡献很小[37]。风干肠成品中OAV大于0.1的酸类物质包括丁酸、戊酸、己酸、癸酸等，来源于脂质降解或氧化。每种短链脂肪酸都有独特的风味。例如，丁酸有腐臭和奶酪味，而己酸有辛辣味，戊酸有腐臭味[25]。 在贮藏过程中这些酸类OAV显著增加，其中，己酸和戊酸在贮藏第77天后分别增了3.20 倍和5.53 倍。另外，支链酸类，3-甲基丁酸有酸味和汗臭味，且在贮藏末期OAV显著提高，这些酸类可能也是异味的贡献者。

2.2.5 风味活性烯烃类物质和杂环类化合物

烯烃类对成品整体风味贡献率为0.5%，随着贮藏时间延长，贡献率逐渐降低。烯烃类物质主要为d-柠檬烯和石竹烯，d-柠檬烯具有柑橘、薄荷味，石竹烯具有木香味。烯烃类来源于产品制备时加入的黑白胡椒[38-39]。不同样品组中还检测出一些OAV大于0.1含氮含氧杂环类物质，如茴香脑、2-丁基呋喃、2-戊基呋喃、均三甲苯、邻-异丙基苯和2,3,5-三甲基吡嗪。其中成品中茴香脑和邻-异丙基苯OAV较高，这可能来源于制作过程中所添加的香辛料，在整个贮藏过程中基本无变化。2-戊基呋喃存在大多数腌腊肉制品中，是亚油酸二次氧化的产物[29]，具有绿豆和黄油的气味，在贮藏前21 d中增加不显著，之后显著增加，增量约是成品的50 倍。另外2-丁基呋喃仅在贮藏末期检测到，因此这2 种呋喃类被认为是异味的因子。2,3,5-三甲基吡嗪是黑白胡椒腊肠中唯一的含氮杂环化合物，是美拉德反应产物，具有奶油香味，在贮藏前期OAV为0.1～0.2，贮藏末期未检测到，说明贮藏后期美拉德反应降低，这可能由于贮藏后期产品水分活度降低抑制了反应的进行。

2.3 贮藏时间、风味感官评分与风味活性物质之间的相关性

表4 贮藏时间、风味感官评分与风味活性物质的Pearson相关系数Table 4 Pearson’s correlation coefficients of odor active compounds with storage time and sensory flavor score

表4仅列出了与贮藏时间、风味感官评分显著相关（P＜0.05）的气味活性物质，表3中56 种风味有17 种化合物，如醛类（2-甲基丁醛、戊醛、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、反-2-辛烯醛、苯甲醛）、醇类（1-辛烯-3-醇、芳樟醇）、酮类（2-庚酮）、酸类（戊酸、己酸、3-甲基丁酸）、酯类（异戊酸乙酯、癸酸乙酯）和2-戊基呋喃，这些风味物质的OAV与贮藏时间呈显著正相关（R=0.828～0.988），并与风味感官评分呈显著负相关（R=-0.979～-0.844），同时贮藏时间与风味评分也显著负相关。这表明随着贮藏时间的延长，这些风味物质的浓度也增加，同时风味也逐渐恶化，因此这17 种化合物是贮藏时间和风味恶化的最佳预测指标。

2.4 黑白胡椒腊肠主体特征风味和异味解析

表5 GC-O法鉴定不同贮藏时间黑白胡椒腊肠中的香气特征Table 5 Aroma characteristics identified by GC-O of Chinese sausages added with black and white pepper at different storage time points

GC-O技术是将GC分离化合物的能力与人的嗅觉相结合，以更好地鉴定气味活性物质及其对总体风味的贡献。由表5可知，反,反-2,4-癸二烯醛、己醛、芳樟醇、庚醛、反,反-2,4-壬二烯醛、反-2-辛烯醛和异戊酸乙酯的气味强度较大，对黑白胡椒腊肠成品贡献脂肪味、油炸味、青草味、果香、花香、奶油味等香气特征，因此这些化合物是腊肠成品的主体特征风味物质，这与OAV结果基本一致。这些化合物来源于脂肪氧化、胡椒和酯化反应，表明一定程度的油脂氧化构成黑白胡椒腊肠香味的基本特征。

食物风味劣变可能是由于对食物产生负面影响的挥发性成分的浓度增加产生的，也可能是由于香味物质的损失，或者是这2 种影响的综合结果。在本研究中，除了具有薯条味的未知物和宜人的花香、柠檬味的胡椒源化合物（芳樟醇、石竹烯、茴香脑、d-柠檬烯、月桂烯、β-蒎烯等）气味强度降低或保持恒定外，脂肪氧化源气味在贮藏的样品中均有所增加。在贮藏末期气味最强烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，在产品中具有深度油炸味和酸败味。结合OAV分析、感官评价及相关性分析结果可知，这8 种化合物的OAV均随着贮藏时间的延长而增大，嗅闻到该化合物气味强度增强，产品的风味逐渐恶化，与风味感官评分显著负相关，因此推测这8 种化合物在贮藏过程中气味的强度大量增加打破了产品微妙的风味平衡，是黑白胡椒腊肠贮藏过程中风味劣变的主要原因。

2.5 基于OAV大于1风味活性化合物的PCA和聚类分析

PCA法是一种通过降维技术将多个变量转化为少数几个PC的实用统计分析方法，能够最大程度地反映原始变量所包含的信息，简化原来的多维问题。

基于筛选出的主体风味成分，采用PCA法对不同贮藏时间点的腊肠进行分析，得到不同贮藏时间腊肠中主体风味成分的得分图（图3A）与相关性载荷图 （图3B）。由图3A可知，PC1贡献率为86%，PC2贡献率为12%，累计贡献率达到98%，表明PC1、PC2能够较好地反映样品特征。除贮藏49 d和77 d的样品在第1象限有重叠，其他贮藏点的4 组样品均没有重叠。与感官评价结果基本相同，说明基于风味活性化合物PCA分析能够将不同贮藏时间的腊肠样品判别出来。不同样品在图3A中的分布呈现明显的变化趋势，随着贮藏时间的延长，样品分布依次从第3象限移动到第2象限，再移动到第1象限，最后移动到第4象限，且样品PC1的得分从负方向依次移动到正方向。贮藏35 d前的样品分布在PC1负方向，而贮藏35 d后的样品分布在PC1正方向，因此贮藏35 d为样品风味恶化的分界，与感官评价结果一致。

变量的载荷系数反映了腊肠中挥发性风味成分对各主成分的影响程度，载荷系数绝对值越大，表明该变量对主成分的贡献也越大。一般来说，分布于得分图特定部分的样本具有载荷图中相同位置变量的许多属性。由图3B可知，沿着PC1，可以观察到仅有5 种风味物质（十二醇、3-羟基-2-丁酮、4-甲基-2-己酮、1-石竹烯和β-蒎烯）的载荷系数为负数。这也表明位于评分图左侧的腊肠成品及贮藏早期的样品中这5 种风味物质有更高的浓度。其他32 种风味物质在横轴上的载荷系数均为正数，其中己醛载荷系数最大，其次是庚醛、辛醛、 1-辛烯-3-醇、2-庚酮、戊酸、己酸、癸酸乙酯、反-2-辛烯醛、2-甲基丁醛。它们彼此接近，即高度正相关，远离中心，大多为脂肪氧化源风味物质。这也意味着位于评分图右侧的样本，即贮藏后期的样品中这几个变量有更高的值。PC2中反,反-2,4-癸二烯醛的载荷系数最高，在PC2的风味信息中起主要作用，可解释风味物质方差信息量的12.00%；各成分中的代表性风味物质在评价腊肠的货架期中有重要的作用。

图3 PCA得分图（A）和相关载荷图（B）Fig. 3 PCA score plot (A) and correlation loadings plot (B)

聚类分析可以直观地对样品进行归类，同时热图将结果以一种渐进的色带直观地展现出来，可以看出样品中风味物质含量的高低程度和变化的趋势[40]。由图4可知，成品和贮藏35 d前的样品被聚为第1组，而贮藏49 d和贮藏77 d的样品被聚为第2组。图4色带表明：除了16（十二醇）、17（4-甲基-2-己酮）和 19（3-羟基-2-丁酮），其余大多数的风味物质在第1组（贮藏初期的样品）中呈现蓝色和白色，在第2组（贮藏后期的样品）中大多数的风味物质呈现黄色，即含量随着贮藏时间的延长而增加。对于风味物质，3（己醛）和12 （反,反-2,4-癸二烯醛）聚为一类，其他34 种风味物质聚为1 类。因此二维聚类热图分析结果与PCA结果基本一致。

图4 二维聚类热图Fig. 4 Heatmap of two-dimensional cluster analysis

3 结 论

采用P&T-TDS-GC-O-MS联用技术结合OAV计算对不同贮藏时间的黑白胡椒腊肠中风味活性化合物进行分析，得到56 种OAV不小于0.1的化合物，其中醛类物质种类（15 种）和OAV占比均最高，对整体风味贡献率高达85.85%～90.35%，主要是源于脂肪氧化的直链醛类；其次为醇类、酯类、酮类、酸类、烯烃类以及其他杂环类物质，共同构成黑白胡椒腊肠的风味。感官评价结果表明随着贮藏时间的延长，黑白胡椒腊肠的颜色逐渐变暗，腊味和胡椒味逐渐降低，贮藏后期异味明显加重，可接受度降低。结合相关性分析确定出17 种风味活性物质的OAV与贮藏时间呈显著正相关，并与风味感官评分呈显著负相关，可作为贮藏时间和风味恶化的最佳预测指标。经GC-O鉴定在贮藏末期气味最强烈的化合物是己醛、反,反-2,4-癸二烯醛、庚醛、辛醛、反-2-辛烯醛、壬醛、1-辛烯-3-醇和反-2-癸烯醛，且它们的OAV大于60，在贮藏过程中气味强度增加，在产品中具有深度油炸味和酸败味，可能是贮藏过程中腊肠氧化变质后产生异味的主要物质。基于OAV大于1风味活性成分，PCA和聚类分析可以作为一种客观的判定和分离不同贮藏时间的黑白胡椒腊肠样品的多元统计分析方法。