张政权，黄冬梅*，蔡友琼，孟宪菁，史永富，孔 聪，黄宣运，汤云瑜，张 璇，杨光昕

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院东海水产研究所，农业农村部远洋与极地渔业创新重点实验室，上海 200090；3.赛默飞世尔科技（中国）有限公司，上海 201206）

中华绒螯蟹又称河蟹、大闸蟹，属于日本绒螯蟹中华亚种，因其风味独特且营养丰富，在我国深受广大消费者的欢迎。自二十世纪七十年代中期以来，中华绒螯蟹在我国的养殖产量迅速增长，目前已经成为我国最主要的水产品之一。中华绒螯蟹的养殖主要集中在辽河、黄河和长江三大水系中[1]，据消费者多年的反馈，长江水系养殖的河蟹无论在口感风味还是个体大小上都相对较好，尤其是以阳澄湖出产的大闸蟹最负盛名，每年大闸蟹上市的季节，阳澄湖大闸蟹都是消费者争相品尝的对象。而现在无论网络上还是水产市场上都能够看到“原产自”阳澄湖的大闸蟹，其中大多数无疑为不良商家为了获取更高利润假冒阳澄湖大闸蟹进行销售，这不仅损害了消费者和当地养殖户的利益，同时还对地区品牌构成了严重威胁。为了规范水产养殖市场秩序，保护消费者和养殖户的合法权益，建立完善的河蟹防伪判别体系，追溯假冒伪劣产品源头至关重要。

传统的水产品产地溯源方法是添加物理防伪标签[2]，这种方式一定程度上能够做到对不同来源的产品进行区分，但也存在一些不足，这些独立于产品之外的防伪标识在加工运输过程中容易造成标签的脱落或损坏导致信息链中断，同时虚假标签的使用更是会让防伪标签形同虚设。因此，急需开发一种新的水产品产地溯源方式，能够反映水产品产地的环境特征和水产品自身的饮食特征，而矿物元素和稳定同位素丰度是目前最能反映这些特征的因素。目前国内外采用矿物元素和稳定同位素技术对茶叶[3-4]、稻米[5-8]、豆类[9-10]、牛羊肉[11-17]等农产品的产地溯源已有一些研究报道，对中华绒螯蟹进行产地溯源的研究，主要集中在对其外部形态和风味特征方面差异性的比较[18-21]，这种研究方式存在很大的局限性，且含主观因素较多，对外部形态相近的水产品很难进行区分，也有学者通过脂肪酸含量[22]、矿物元素含量[23-24]等方面对不同地区的中华绒螯蟹进行了区分，但仅局限于采用单一技术对中华绒螯蟹溯源的研究，暂未发现采用矿物元素与稳定同位素结合的方式对长江水系的中华绒螯蟹进行产地溯源。本研究采用矿物元素含量和稳定同位素丰度结合的方式，比较长江水系中阳澄湖、崇明和兴化3 个地区河蟹的8 种矿物元素的含量和C、N稳定同位素丰度，利用SPSS 19.0数据处理软件对所得数据进行方差分析和显著性比较，利用聚类分析对3 个地区的样品进行了初步聚类，利用线性判别分析对样品进一步归类比较，并建立产地判别模型，然后利用主成分分析筛选出能够区分3 个地区河蟹的特征指标，以期实现对中华绒螯蟹的产地溯源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

河蟹样品由养殖户协助于2019年7月分别于阳澄湖中、兴化养殖塘和崇明养殖塘捕捞，雌蟹和雄蟹各10 只，质量范围在63～107 g之间，每个样品分别用自封袋封装编号并立即运回实验室（表1）。取其腿部及腹部肌肉混合均匀，将样品放入真空冷冻干燥机连续干燥至恒质量后，研磨过100 目筛，放入干燥器中保存备用。

表1 河蟹样品基本信息Table 1 Information about crab samples collected for this study and their geographical origins

硝酸（分析纯） 江苏晶锐化学股份有限公司；超纯水、过氧化氢（分析纯） 上海安谱实验科技股份有限公司；1 mg/mL K、Ca、Na、Mg、Mn、Zn、Cu、Fe元素单标准液 国家标准物质认证中心；稳定同位素标准品USGS40 东莞市谱标实验器材科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Milli-Q ELEMENT超纯水机 美国默克密理博 公司；FreeZone真空冷冻干燥机 美国Labconco公司；JA5000C精密电子天平 常州市幸运电子天平有限 公司；ETHOS 1微波消解仪 意大利迈尔斯通公司；HP-H35SC电加热板 盛达杰森自动化设备有限公司；ContrAA-700原子吸收光谱仪 德国耶拿分析仪器股份公司；EA IsoLink元素分析仪、DELTA V Advantage同位素比率质谱仪 美国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 元素测定

准确称取0.5 g样品于50 mL尖底离心管，加入5 mL硝酸和1 mL过氧化氢，放置于通风橱酸解过夜，第2天将酸解后的样品转移至微波消解罐中放入微波消解仪中消解。将消解后的样品放置加热板上赶酸至溶液呈澄清并有白色烟雾冒出，取出放置至室温，定容稀释上机。样品液经进样管进入雾化器，经雾化成为水蒸气进入原子化器，水蒸气在原子化器内被空气-乙炔混合气体燃烧产生的高温原子化，同时吸收光源产生的电磁辐射，电磁辐射能的吸收与蒸汽中被测元素的含量呈正比，通过最终测定的吸光度可以计算出待测元素的含量。本研究测定8 种矿物元素的标准曲线线性相关系数均在0.999以上，方法的回收率为96.0%～106.9%，精密度为1.1%～5.4%，各元素的方法检出限分别为K 118.0 mg/kg、Ca 19.0 mg/kg、 Na 101.0 mg/kg、Mg 89.0 mg/kg、Mn 0.06mg/kg、Zn 0.70 mg/kg、Fe 0.44 mg/kg、Cu 0.10 mg/kg。

1.3.2 稳定同位素测定

用百万分之一天平准确称取400～450 μg蟹肉干粉包裹在锡纸杯里，依次放入进样盘中，样品通过自动进样器进入EA IsoLink元素分析单元，在元素分析单元中燃烧并被还原成纯净的CO2和N2，经过ConFlo IV连续流接口装置经氦气稀释后进入DELTA V Advantage稳定同位素质谱仪进行检测。仪器条件如下：载气流速180 mL/min，进样口吹扫速率70 mL/min，氧气流速175 mL/min，燃烧炉温度980 ℃，还原炉温度55 ℃，每测定20 个样品插入2 个USGS40（咖啡因）标准品进行质量控制。CN稳定同位素的测试精度均优于0.1‰。

稳定性C、N同位素丰度分别表示为δ13C、δ15N，其中δ13C的相对标准为V-PDB（维也纳-PeeDee箭石标准），δ15N的相对标准为空气中的N2。计算公式如下：

式中：R为重同位素与轻同位素的丰度比，即13C/12C、15N/14N。

1.4 数据处理软件

采用SPSS 19.0数据处理软件对实验结果进行方差分析、显著性比较、系统聚类分析、线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）和主成分分析（principal component analysis，PCA），采用SPSS 19.0作样品分布散点图。

2 结果与分析

2.1 元素含量和稳定同位素丰度产地差异分析

如表2、3所示，8 种元素和2 种稳定同位素在3 个地区的样品中呈现不同程度的差异。单因素方差分析和Duncan多重比较分析结果显示K、Mg、Cu三种元素在3 个地区间均存在显著差异（P＜0.05），且K和Cu在崇明地区的样品中含量最高，Mg在阳澄湖地区的样品中含量最高。Na在崇明和兴化地区的样品中含量差异不显著 （P＞0.05），但Na在两地区样品中的含量均明显高于阳澄湖地区（P＜0.05）。Ca和Zn在崇明和兴化2 个地区样品中的含量差异不显著（P＞0.05），且均显著低于阳澄湖地区（P＜0.05）。而Fe、Mn和δ15N在崇明和阳澄湖2 个地区样品中的含量差异不显著（P＞0.05），但均显著高于兴化地区（P＜0.05）。δ13C在阳澄湖与兴化两地区样品中差异不显著（P＞0.05），且都显著高于崇明地区（P＜0.05）。鉴于三地区样品中8 种矿物元素含量和C、N稳定同位素丰度的差异，表明利用这种差异区别三地区的样品具有一定的可行性。

表2 矿物元素含量（干质量）测定结果Table 2 Mineral element contents of crab samples mg/kg

表3 稳定同位素丰度测定结果Table 3 Stable isotope abundance in crab samples‰

2.2 聚类分析

图1 3 个地区样品的系统聚类结果Fig. 1 Systematic clustering resultsof three regional samples

为观察矿物元素与稳定同位素结合在对三地区样品归类方面的能力，将这8 种元素和C、N稳定同位素丰度作为共同变量采用系统聚类方式对三地区的60 个样品进行聚类，聚类结果（图1）显示，在欧式距离为6处将树状图切断，可将样品大致分为两大类，第1大类22 个样品中有16 个为兴化地区样品，6 个为阳澄湖地区样品，兴化地区样品占总数的72.7%，占兴化地区样品总量的80.0%，第2大类30 个样品中有16 个为崇明地区样品，占样品总量的53.0%，占崇明地区样品总量的80%，11 个为阳澄湖地区样品，占样品总量的36.7%，占阳澄湖样品总量的55.0%，3 个为兴化地区样品，另外有1 个兴化样品、3 个阳澄湖地区样品和4 个崇明地区样品被错误分成了3 小类。聚类分析结果总体上将兴化地区样品单独聚为一类，将阳澄湖和崇明地区样品共同聚为一类，显示综合矿物元素和稳定同位素在对3 个地区的样品进行探索性聚类方面表现出一定的能力，但是聚类效果还不够理想，存在较多的误判样品。

2.3 LDA结果

LDA是一种有监督的数据归类方式，可以在假设样品分类的基础上把已知样品作为训练集，利用各类样品之间的相关性建立判别模型，从而可以利用判别模型对未知样品进行判别归类，还可以采用“留一法”交叉验证把训练集中的除某一个样品之外的其余样品作为训练集，建立相关的判别函数对该样品进行判别，在这个过程中，总样品中的每一个个体都被除该个体之外的样品建立的判别函数进行验证，从而极大地检验了判别模型的稳定性。本研究采用步进式DA方法，按照每个变量在判别分析过程中的重要性由大到小逐步选为判别变量，建立分类判别函数。如表4所示，崇明和兴化地区的样品实现了全部100%的正确分类，阳澄湖地区的样品有1 个被误判为崇明地区，正确判别率为95.0%，三地区样品的总体正确判别率为98.3%，交叉验证结果中阳澄湖地区的1 个样品被误判到崇明地区，虽然3 个地区中有个别样品出现了误判，其总体的交叉验证判别正确率仍然高达98.3 %。

表4 LDA及交叉验证结果Table 4 LDA and cross-validation results

本次判别分析采用矿物元素结合稳定同位素建立2 个典型判别式函数，其中函数1的方差贡献率为88.9%，函数2的方差贡献率为11.1%，利用这2 个判别函数分别作为横纵坐标建立坐标系，得到3 个组的散点图，由图2可以直观地看出3 个地区的所有60 个样品均被明显分为3 个区域。说明本次判别分析建立的判别函数对来自3 个地区的样品具有很好的分类效果。

图2 典型判别式函数分类图Fig. 2 Good classification of three regional samples with typical discriminant functions

2.4 PCA结果

PCA运用数学降维的分析方式，能够将几组具有相关性或相似性质的变量合并为一组，选取主要成分，减少分析变量，最终实现简化判别模型的目的。本研究通过设置特征值大于1的成分作为PC，最终筛选出4 个PC，累计方差贡献率为74.8%，其中PC1主要综合了K、δ15N的信息，PC2中主要综合了Mg、Ca的信息，PC3中的主要贡献元素为Mn、Fe，PC4中的主要贡献元素为Na、Zn。通过比较各个主成分组合对样品的分类效果，选取PC1、PC2、PC4分别作为Z轴、Y轴和X轴作散点图，得到三地区样品在三维坐标系中的空间分布图，由图3可以看出，3 个地区的样品分别分布在空间坐标系的3 个不同的区域，PCA结果表明，采用PC1、PC2、PC4可对三地区的样品实现正确分类，说明K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N是区分3 个地区河蟹的特征指标。

图3 三地区样品在PC坐标系中的分布Fig. 3 Distribution of three regional samples in the PC coordinate system

3 讨 论

由于生物体本身不能合成矿物元素，其体内的矿物元素含量均来自日常饮食和其生长的环境中[25-26]，因此两者之间存在显著相关性，这就为利用矿物元素区分不同地区的水产品提供了理论基础，郭利攀等[27]利用电感耦合等离子体质谱仪和原子吸收光谱测定东海3 个地区经济鱼类的25 种金属元素，采用偏最小二乘-判别分析对3 个地区的样品实现了97.92%的正确分类，并且通过主成分分析筛选出对鱼类产地区分影响最为显著的矿物元素，在自然状态下，生物体内的稳定同位素组成由于气候、环境和生物代谢类型等影响因素发生自然分馏效应而存在一定的差异[28-29]，这种差异是生物体一种自然属性，可为区分不同来源的生物提供判别依据。郭捷敏等[30]比较了野生和人工养殖环境中的红树林青蟹的C、N稳定同位素组成，发现野生环境下的青蟹与人工养殖环境下的青蟹具有不同的C、N稳定同位素组成，可作为青蟹产地区分的主要依据。马冬红等[31]利用氢稳定同位素对我国广东、海南、广西和福建4 个地区的罗非鱼实现了85%的判别正确率，Sant’Ana等[32]发现C、N稳定同位素指标的结合在无论雨季还是旱季都能够对巴西淡水鲶鱼提供很好的溯源效果，在本研究中，N稳定同位素在区分3 个地区的样品时表现出一定的优势，δ15N在3 个地区蟹肉中的含量由大到小为阳澄湖＞崇明＞兴化，通过对3 个地区河蟹人工饵料和池塘底泥中N稳定同位素的测定，发现3 个地区饵料中δ15N丰度比由大到小为阳澄湖（3.78）＞崇明（2.95）＞兴化（2.20），底泥中δ15N丰度比由大到小为阳澄湖（9.46）＞崇明（3.35）＞兴化（1.60），虽然河蟹在长期的饲养过程中摄入食物的种类较为复杂，除了人工饵料还可能摄入养殖水域中其他小型鱼类和植物，但本研究证实了δ15N在3 个地区的蟹体、饵料和底泥中呈现显著相关性，表明环境和饮食方面的N摄入对蟹体中δ15N具有积极的影响，从而为利用δ15N对不同地区河蟹的区分提供了有力的证据，通过将稳定同位素丰度与矿物元素含量结合对3 个地区的样品实现了98.3%的正确分类。这些结果表明，不管是采用多种矿物元素还是采用矿物元素与稳定同位素结合的方法都能够产生很好的判别效果，并且采用矿物元素和稳定同位素相结合的方法能更好地提高判别模型的稳定性。

多元统计分析能够在多个对象和多个指标相互关联的情况下分析它们的统计规律，其主要内容包括多元线性回归分析、PCA与因子分析、DA与聚类分析[33]。近年来随着科研工作的深入，多元统计分析在食品的产地溯源领域得到了越来越广泛的应用[34-35]。本研究采用8 种矿物元素和2 种稳定同位素作为变量，对崇明、兴化和阳澄湖3 个地区的河蟹进行方差分析和显著性比较，发现各变量在3 个地区的样品都存在不同程度的差异，同时聚类分析和LDA在对3 个地区的样品分类方面也取得了良好的效果，聚类分析大体上将兴化地区的样品分为一类，将阳澄湖和崇明的样品共同归为一类，这可能是因为阳澄湖和崇明两个地区在地理位置上距离较近，环境条件相似所致，LDA对3 个地区样品的交叉验证判别正确率为98.3%，证明线性判别分析对三地区河蟹的判别分类具有很好的效果。PCA最终筛选出4 个主成分，利用不同元素在各个PC中的载荷及各元素在3 个地区样品中含量的差异性，最终选取了PC1、PC2和PC4成功将3 个地区的样品分成了3 个不同的区域，从而提取出K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N 6个特征变量，为判别模型的优化提供了方向。

4 结 论

本研究利用原子吸收光谱仪和稳定同位素比率质谱仪分别测定了崇明、阳澄湖和兴化3 个地区河蟹肌肉组织中的8 种矿物元素含量和C、N稳定同位素丰度，结果显示，这8 种元素和2 种稳定同位素丰度在3 个地区间存在不同程度的差异，其中K、Mg和Cu这3 种元素在3 个地区间都存在显著差异（P＜0.05），系统聚类结果整体上将兴化地区的样品单独归为一类，将阳澄湖和崇明样品共同归为一类，采用LDA对3 个地区的样品建立判别模型，得到崇明、阳澄湖、兴化三地区样品的初始判别正确率分别为100%、95%和100%，整体初始判别正确率为98.3%，交叉验证结果为98.3%，表明采用这8 种矿物元素建立判别模型可以对3 个地区的样品实现正确区分。利用PCA筛选出4 个PC，主要贡献元素为K、Mg、Ca、Na、Zn和δ15N，这4 个PC的累计方差贡献率为74.8%，选用PC1、PC2、PC4建立坐标系，绘制散点图，对三地区的样品实现了正确区分。本研究结果表明，矿物元素结合稳定同位素的分析技术对中华绒螯蟹的产地溯源具有一定的优越性，可以为全国范围内的河蟹产地溯源鉴别提供理论基础和方法参考。