王储炎，张继刚，杨柳青，李珂昕，蔡敬民，胡 勇，欧晓华

（1.合肥学院生物食品与环境学院，安徽 合肥 230601；2.安庆蓝莓农业科技有限公司，安徽 安庆 246113；3.安徽省农业科学院农产品加工研究所，安徽 合肥 230031）

蓝莓为杜鹃花科越橘属多年生落叶小灌木，原产于加拿大东部和美国东北部，后在我国东北的大小兴安岭地区发现了野生蓝莓，2000年后陆续在中国南方和欧洲地区栽培种植[1-3]。蓝莓果实营养丰富，酸甜可口，含有糖、蛋白质、有机酸、多酚、维生素和超氧化物歧化酶等成分，被誉为浆果之王，长期食用具有增强视力、预防心血管疾病、解毒以及促进人体健康的功效，因而被联合国粮农组织推荐为人类五大健康食品之一[4-7]。

蓝莓因富含多酚、原花青素等生物活性成分，被认为是自然界中最具抗氧化活性的水果之一，特别是原花青素的抗氧化能力是VC的数倍以上[8-9]。原花青素是植物中广泛存在的一大类多酚类化合物总称，属于多酚，而多酚是指分子结构中有若干个酚性羟基的植物成分的总称，除原花青素外，还包括酚酸类、黄酮类、单宁类以及花色苷类等。蓝莓多酚在植物中以游离态和通过酯键、醚键、缩醛键等与细胞骨架紧密结合的2 种形式存在，通常研究主要集中为游离态，忽略结合态，实际上，被人体食用后，不可溶的结合态多酚最终向结肠释放的抗氧化剂更多[10-12]。因此，确定游离态和 结合态的多酚和原花青素等活性成分的含量就显得尤为重要。

利用微生物发酵技术提高活性成分的含量，是近年来发酵技术一个新的研究方向。Johnson等[13]对蓝莓果酒进行发酵时，发现发酵过程有助于提高蓝莓多酚含量，增强其抗氧化能力。Oh等[14]利用酵母对蓝莓果汁进行发酵，结果显示发酵后蓝莓抗菌性和抗氧化活性均明显增强。乳酸菌主要是指能利用碳水化合物进行发酵，产生以乳酸等有机酸为主要发酵产物的一群最具代表性的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[15-16]。乳酸菌发酵已是备受关注的最简单和有效保持与提高果蔬营养价值和风味的一种处理方式[17]，研究证实肠道中乳酸菌可以代谢产生叶酸等维生素，是宿主维生素的主要来源之一[18]。而通过开展益生乳酸菌发酵提高蓝莓活性成分含量，目前鲜有报道。本实验以嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌为发酵菌种，通过研究发酵前后游离态和结合态蓝莓多酚和原花青素的含量变化，进而分析蓝莓多酚中单体酸以及蓝莓原花青素的组成，同时检测发酵前后蓝莓多酚抗氧化活性，旨在为蓝莓产品开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓品种为巴尔德温，购自中国安徽省的安庆蓝莓农业科技有限公司。实验所用乳酸菌为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（L. casei）、副干酪乳杆菌（L. paracasei）均来自中国海洋大学生命科学学院微生物实验室。

没食子酸、芦丁、槲皮素、丁香酸、咖啡酸、香草酸、对羟基苯甲酸、儿茶素、原儿茶酸、对香豆酸、原花青素B1、B2、B3 美国Sigma-Aldrich公司； 甲醇、乙腈、乙酸、乙酯（均为色谱级）、福林-酚、 1,1-二苯基-2-三硝基苦肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、NaOH、Na2CO3、NaNO2、HCl、AlCl3、H2SO4、过硫酸钾（均为分析级） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Acquity超高效液相色谱系统、TSQ Quantum Discovery MAX三重四极杆质谱分析联用仪 美国 Thermo Scientific公司；MJ-BL80Y21破壁料理机 广东美的生活电器制造有限公司；Alpha 1-4 LSCplus真空冷冻干燥机 德国Christ公司；745P型紫外分光光 度计、752PC紫外-可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司； 恒温水浴锅 国华电器有限公司；ZHWY-211B摇床发酵箱 上海智城分析仪器制造有限公司；VC505超声波细胞破碎仪 美国Sonics公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

首先将乳酸菌活化，接入MRS液体培养基，37 ℃培养24 h，然后4 000 r/min离心10 min，用无菌生理盐水清洗沉淀菌落后溶于蒸馏水，配制成活菌数为2.6×109CFU/mL的菌悬液。

1.3.2 蓝莓乳酸菌发酵工艺

称取50 g蓝莓冻果，经解冻、破碎、打浆制成浆液，进而添加1.0 g酵母膏补充氮源，然后均质5 min，用食品级NaOH溶液调pH值至4.5，此时糖质量浓度为50.88 g/L。然后按5%体积比接种乳酸菌，置于37 ℃培养35 h左右，待活菌数达到109CFU/mL时，视为发酵终点，将发酵后的蓝莓浆液经冷冻干燥成样品，待测。另外，设置不接种乳酸菌的蓝莓浆液作为发酵对照，每组3 个重复。

1.3.3 前处理与测定

1.3.3.1 样品前处理

称量0.2 g干燥样品，用5 mL甲醇溶解，50 ℃超声萃取40 min，3 500 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm滤膜过滤后，作为样液1。

在滤渣中加入5 mL 4 mol/L的NaOH溶液，30 ℃振荡水解4 h，于3 500 r/min离心10 min，取上清液。用 6 mol/L HCl溶液调pH值至2.0，加入25 mL乙酸乙酯，在分液漏斗中萃取，取上层液在35 ℃旋转蒸干，然后用4 mL甲醇溶解，0.22 μm滤膜过滤后，作为样液2。

1.3.3.2 多酚含量测定

采用福林-酚法测定多酚含量[19]。取250 μL样液1或2，分别测定游离态和结合态多酚的含量。样品溶液加入250 μL福林-酚试剂，混匀反应5 min，加入500 μL水和250 μL 20%的Na2CO3溶液，混匀避光反应30 min，然后用酶标仪在740 nm波长处测定吸光度，以甲醇溶液为空白对照，以没食子酸溶液为标准品，得到回归方程y=9.680 2x＋0.082 3（0.01～0.1 mg/mL，R2=0.998 2）。多酚含量表示为每1 0 0 g 蓝莓粉中含有的没食子酸 当量（mg/100 g，干质量），总酚含量即为游离酚和结合酚含量的总和。

1.3.3.3 原花青素含量测定

原花青素含量测定采用香草醛-H2SO4法[20]。取20 μL样液1或2，分别测定游离态和结合态原花青素的含量。样品溶液与100 μL香草醛-甲醇溶液混合，加入100 μL的H2SO4-甲醇溶液，暗室反应5 min，于500 nm波长处测定吸光度，以儿茶素溶液为标准品作标准曲线，得到回归方程为y=2.122 9x-0.000 3（0.04～0.8 mg/mL，R2=0.999 5）。结果表示为每100 g蓝莓粉中含有的儿茶素当量毫克数（mg/100 g，干质量），原花青素总含量即为游离态原花青素和结合态原花青素的含量总和。

1.3.3.4 酚酸和原花青素组成测定

多酚中酚酸和原花青素组成采用Acquity超高效液相色谱耦合TSQ Quantum三重四极杆质谱联用仪进行测定。流动相：A为乙腈＋0.1%乙酸（V/V），B为水＋ 0.1%乙酸（V/V），进行梯度洗脱。色谱条件：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），进样体积5 μL，流速300 μL/min，柱温30 ℃，流动相洗脱程序：0～5 min，5%～10% A，95%～90% B；5～7 min，10%～20% A，90%～80% B；7～8 min，20%～60% A，80%～40% B；8～9 min，60%～100% A，40%～0% B；9～10 min，100%～5% A，0%～95% B。使用电喷雾电离在选定的检测模式下进行质谱监测，检测参数为：蒸发器温度450 ℃，电晕放电4.0 kV，毛细管温度225 ℃，护套氮气压力17 psi；辅助氮气压力5 psi，碰撞气体压力1.5 mTorr。经过SRM优化后的酚酸和原花青素的母离子和子离子进行定性定量分析，进而通过Xcalibur软件对LC-MS系统数据进行处理。

1.3.4 DPPH自由基清除能力测定

参考文献[21-22]方法，吸取50 µL待测液加入到150 µL 0.3 mmol/L DPPH-甲醇溶液中，混匀后于暗处30 ℃反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度，以槲皮素甲醇溶液作阳性对照，50 µL甲醇代替样品加入到DPPH-甲醇溶液中作为空白对照，得到DPPH自由基清除率与槲皮素含量之间的回归方程y=0.247 8lnx＋1.412 3（0.01～0.2 µmol/L，R2=0.986 1），即为每克样品相当于槲皮素质量（mg/g）表示。

1.3.5 ABTS阳离子自由基清除能力测定

参考薛自萍[23]、Ozgen[24]等方法，将1.1 mg/mL ABTS-甲醇溶液和0.68 mg/mL过硫酸钾溶液等体积混合作为ABTS阳离子自由基工作液，暗室静置过夜，测定采用甲醇稀释调整吸光度至0.700。取150 µL试剂于96 孔板中，加入50 µL样液，室温暗处反应30 min。50 µL甲醇代替样品加入ABTS阳离子自由基工作液中，作为阴性对照，用酶标仪在734 nm波长处测定吸光度。以Trolox-甲醇溶液为标样，得出清除率与Trolox含量的回归方程y=-0.973 5x＋1.450 5（0.1～1 µmol/L，R2=0.990 9），ABTS阳离子自由基清除能力采用每克样品相当于Trolox质量（mg/g）表示。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌发酵对蓝莓多酚含量的影响

表1 发酵前后蓝莓多酚含量的变化Table 1 Changes in blueberry polyphenols contents before and after fermentation

从表1可知，蓝莓原料中游离酚、结合酚及总酚含量分别为483.2、121.4、604.6 mg/100 g，其中游离酚占总酚含量的79.9%，这与其他学者对蓝莓总酚研究的结果相一致[25-27]。发酵前后，蓝莓游离酚、结合酚和总酚含量呈现显著差异。具体表现为：与对照组相比，嗜酸乳杆菌发酵降低了蓝莓游离酚含量（464.8 mg/100 g），干酪乳杆菌未引起蓝莓游离酚显著变化，而副干酪乳杆菌显著增加了游离酚含量（512.8 mg/100 g），而且3 种乳酸菌的发酵都显著增加了蓝莓结合酚含量（增幅分别达41.6%、36.7%、47.7%）。在总酚含量上，嗜酸乳杆菌与对照组无显著差异，而干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌分别提高总酚含量8%和12.2%。同时，乳酸菌发酵前后游离酚、结合酚占蓝莓多酚含量的比例基本维持在80%和20%，变化不是特别明显。

通过对比发现，动态的乳酸菌发酵过程对蓝莓中的酚类代谢和转化也有增益，其中副干酪乳杆菌显著增加了游离酚、结合酚和总酚含量，其他2 种则部分降低或消耗了酚类含量。目前利用乳酸菌进行蓝莓发酵的相关研究报道较少，其中Yan Yehua等[28]对蓝莓果渣进行乳酸菌发酵时发现，总酚含量有所增加。Ryu等[29]对蓝莓进行植物乳杆菌发酵时发现发酵提高了部分酚酸含量，朝着有益于提高抗氧化活性的方向进行。根据结果推测，乳酸菌是影响蓝莓游离酚、结合酚和总酚含量的关键，不同乳酸菌代谢酚酸的途径和能力差异巨大，本研究中副干酪乳杆菌增加总酚含量的能力最强。

2.2 乳酸菌发酵对蓝莓原花青素含量的影响

表2 发酵前后蓝莓原花青素含量的变化Table 2 Changes in blueberry proanthocyanidins contents before and after fermentation

原花青素也叫前花青素，在酸性介质中加热均可产生花青素，其具有极强的抗氧化活性，是一种良好的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[30]。由表2可知，蓝莓原料中游离态、结合态和总原花青素含量分别为1 194.3、93.8、1 288.1 mg/100 g，说明果实中绝大多数都以游离态存在，占原花青素总量的92.7%。随着发酵进行，发酵对照和乳酸菌发酵组的总原花青素均显著低于原料，这可能有蓝莓原花青素不太稳定的原因，但同时又发现，3 种乳酸菌发酵组的下降趋势更加明显，尤其是副干酪乳杆菌组发酵后达到最低，只有353.5 mg/100 g。游离态原花青素在嗜酸乳杆菌组、干酪乳杆菌组和副干酪乳杆菌组之间无显著差异，但是显著低于蓝莓原料组和发酵对照组，分别为290.0、324.2、309.1 mg/100 g，与蓝莓原料组相比，乳酸菌组游离态原花青素占比也显著降低，分别降至75.3%、81.7%和87.4%；结合态原花青素占比得到明显提升，其中嗜酸乳杆菌含量还高于原料含量，达到94.9 mg/100 g，干酪乳杆菌结合态花青素含量也高于发酵对照组。由此可推测，蓝莓中游离态原花青素有向结合态原花青素转变的趋势。

2.3 乳酸菌发酵对蓝莓多酚中酚酸单体的影响

表3 发酵前后酚酸含量的变化Table 3 Changes in phenolic acids contents before and after fermentation μg/g

乳酸菌发酵前后蓝莓中9 种主要酚酸单体通过超高效液相色谱耦合三重极杆串联质谱被测定，这9 种酚酸分别是原儿茶酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、丁香酸、儿茶素、表儿茶素、香草酸、槲皮素、对香豆酸。这些酚酸单体在蓝莓原料和经不同乳酸菌发酵前后以游离态、结合态存在，含量变化如表3所示，对应色谱图如图1所示。除表儿茶素外，其他酚酸都以游离态和结合态2 种形式存在，原儿茶酸、香草酸、丁香酸、对香豆酸主要以结合态形式存在，而咖啡酸、儿茶素、槲皮素则主要以游离形式存在。从表3可知，蓝莓中酚酸含量由高到低分别是丁香酸（112.9 μg/g）、原儿茶酸（92.4 μg/g）、 咖啡酸（25.3 μg/g）、香草酸（20.2 μg/g）、儿茶素（18.8 μg/g）、对香豆酸（9.5 μg/g）、对羟基苯甲酸（4.7 μg/g）、表儿茶素（3.9 μg/g）、槲皮素（2.6 μg/g）。

图1 发酵前后游离酚、结合酚对应酚酸单体组成Fig. 1 Chromatograms of free and bound phenols and corresponding phenolic acids before and after fermentation

经过3 种乳酸菌发酵，蓝莓中各种酚酸含量均发生了显著的变化。与发酵对照组相比，嗜酸乳杆菌发酵提高了原儿茶酸（7.3%）、丁香酸（55.2%）、咖啡酸（35.4%）含量，降低了儿茶素（22.1%）含量，而对香草酸、对羟基苯甲酸、槲皮素、对香豆酸含量未产生明显影响；干酪乳杆菌发酵显著提升丁香酸含量，降低了咖啡酸和香豆酸含量，对其他酚酸无显著影响；而副干酪乳杆菌发酵则显著提高丁香酸、对羟基苯甲酸、槲皮素、原儿茶酸含量，降低了咖啡酸含量，对其他酚酸的影响不大。此外，发酵对照组与原料之间的酚酸含量也有差异，这种差异可能是由发酵工艺及所处环境所决定，因此导致了原儿茶酸、香草酸、丁香酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素等含量增加，特别是槲皮素增加异常显著，由原料中2.6 μg/g，增加到23.7、21.9、21.2、33.6 μg/g，分别增加了811.5%、742.3%、715.4%、1 192.3%，这是本研究中一个新的发现。

2.4 乳酸菌发酵对蓝莓原花青素组成的影响

原花青素是以黄烷-3-醇为结构单元并通过C—C键聚合形成的化合物，分为单倍体、寡聚体和多聚体[31]，其中黄烷-3-醇通过C4—C8或C4—C6键连接在一起的B型花青素在自然界中含量最多，蓝莓中花青素也以此类为主。如表4和图2所示，蓝莓原料中原花青素B1、B2、B3含量分别为137.3、5.2、22.2 μg/g，其中B1为原花青素主要组成，占比高达83.1%。通过乳酸菌发酵，原花青素B1、B2、B3和总原花青素含量得到显著提升，但与对照组相比，副干酪乳杆菌显著提高原花青素B1和总原花青素含量，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌发酵对原花青素影响并不显著。

表4 发酵前后蓝莓原花青素组成变化Table 4 Changes in blueberry proanthocyanidins composition before and after fermentation

图2 发酵前后对应原花青素B1、B2、B3含量的变化Fig. 2 Chromatograms of blueberry proanthocyanidins B1, B2 and B3 before and after fermentation

2.5 乳酸菌发酵对蓝莓多酚抗氧化活性的影响

2.5.1 DPPH自由基清除能力

图3 发酵前后蓝莓多酚对DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capability of blueberry polyphenols before and after fermentation

从图3可知，蓝莓原料中总酚对DPPH自由基的清除能力为2 378.8 mg/g，游离酚和结合酚的抗氧化能力分别占43.3%和56.7%。经过乳酸菌发酵后，游离酚和总酚的清除DPPH自由基能力显著提升，其中，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌对应游离酚清除DPPH自由基能力分别提升42.6%、45.4%和41.3%。比较结合酚对DPPH自由基的清除能力发现，嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌出现降低，而副干酪乳杆菌则与原料持平，同时，总酚清除DPPH自由基的能力分别提升14.1%、6.8%和18.1%。乳酸菌横向对比发现，副干酪乳杆菌比其他乳酸菌发酵，能更好地提升蓝莓对DPPH自由基的清除能力，这与李虹甫[32]通过植物乳杆菌来发酵蓝莓果汁，进而提升其对DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除能力方面基本一致。

2.5.2 ABTS阳离子自由基清除能力

图4 发酵前后蓝莓多酚对ABTS阳离子自由基的清除能力Fig. 4 ABTS radical cation scavenging capability of blueberry polyphenols before and after fermentation

从图4可知，蓝莓原料中总酚对ABTS阳离子自由基的清除能力为973.7 mg/g，游离酚为925.1 mg/g，结合酚为48.6 mg/g，游离酚占总酚ABTS抗氧化能力的95%，这与清除DPPH自由基能力中结合酚所占比例有所差异。通过发酵之后，游离酚和结合酚抗氧化能力得到显著提升，副干酪乳杆菌和干酪乳杆菌提升最大。同时发现，发酵对照组的抗氧化能力仍然有显著提升，这说明多酚结构在液体状态时不太稳定，仍然在进行着相关的化学变化。通过实验发现，干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌发酵后，蓝莓多酚对ABTS阳离子自由基的清除能力显著高于发酵对照组。随着乳酸菌发酵的进行，结合酚的清除能力呈现明显上升趋势，总之，乳酸菌增强了蓝莓多酚对ABTS阳离子自由基的清除能力，这与其增强了对DPPH自由基清除能力的结果一致。

3 结 论

近年来，多酚类化合物对人体健康的重要性越来越受科学界的关注，比如葡萄中含有包括白藜芦醇和多种类黄酮成分在内的许多有益人体健康的有机化合物，蓝莓也因其富含酚酸、原花青素等活性成分，被认为是自然界中最具抗氧化活性的水果之一。本实验主要研究蓝莓经过乳酸菌发酵后多酚和原花青素含量的变化情况。由结果可知，嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和副干酪乳杆菌发酵对蓝莓中游离酚、结合酚和总酚含量的影响不同，其中副干酪乳杆菌发酵提升蓝莓总酚的能力最强，降低了结合态原花青素的含量，通过乳酸菌发酵后，蓝莓清除DPPH自由基和ABTS阳离子自由基能力都得到了显著地提升。总之，乳酸菌发酵会对蓝莓中多酚和原花青素含量产生明显地变化，进一步提高了结合态有机物的含量，增强了蓝莓多酚的抗氧化活性，提升了蓝莓发酵饮品的营养价值。