靳登鹏，周 雄，刘 焕，杨 娇，黄卓权，卜玲玲，柯倩华，柳春红

（华南农业大学食品学院，广东省食品质量安全重点实验室，农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（广州），广东 广州 510642）

婴儿期是人类一生中十分特殊的阶段，其生长、智力发育最为迅速，需要特殊的营养物质[1]。在婴儿的胃肠道发育、免疫功能等方面，营养素发挥十分重要的作用[2]。 母乳是新生儿最重要的食物，其独特的营养物质、免疫和抗感染因子等都有助于满足生长发育的关键需求[3]，特别是母乳中的蛋白质更是与婴儿的健康、生长和发育密切相关[4-7]。世界卫生组织建议在婴儿出生后的前6 个月，婴儿唯一的营养来源应该是母乳，而母乳作为婴儿营养的主要来源应该继续持续1～2 a[8]。但是半岁左右的婴儿单靠母乳喂养不能满足其生理需求，必须通过添加辅食摄取额外的营养素和能量[2]，目前一般选择婴幼儿配方奶粉作为营养补充食物。乳蛋白作为母乳中最主要的成分之一，对婴幼儿的健康成长具有非常重要的作用。

研究[9-11]表明，母乳中的蛋白质是由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂球膜蛋白和乳外泌体组成。随着蛋白质组学技术的不断发展，越来越多的人开始热衷于乳清蛋白质组学研究。乳清蛋白是母乳脱脂去除酪蛋白后，上清液中所含有的蛋白质，主要含有α-乳白蛋白、蛋白酶、免疫球蛋白等[12-15]，还含有具有重要生物学特定功能的低丰度蛋白，它主要参与新陈代谢、转录和翻译等多种生理及病理过程[16]。在利用蛋白质组学技术分析低丰度蛋白时，质谱中的信号易被高丰度蛋白所影响，如何除去高丰度蛋白显得尤为重要。Yamada等[17]通过免疫吸附的方法除去牛奶中的β-酪蛋白及免疫球蛋白后，发现了特异的低丰度蛋白质；Holland等[18]利用半胱氨酸标签法移除了乳清中的αs1-酪蛋白和β-酪蛋白后，对其他类型的酪蛋白进行了分析。

由于母乳中还有大量低丰度蛋白的生理功能尚不清楚，而且国内关于免疫亲和层析和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒2 种方法去除母乳中高丰度蛋白的报道较少。因此，本研究通过免疫亲和层析和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒2 种前处理方法除去部分高丰度蛋白，富集低丰度蛋白，最后经过LTQ Orbitrp Velos质谱仪检测，并进行相关的生物信息分析，研究结果将有助于加深对人类乳蛋白质组的了解，为婴幼儿的健康成长和疾病预防提供理论依据，同时也可为母乳喂养的保护作用机制及有关乳腺疾病的研究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

日龄80～90 d的雌性白兔购自广东省医学实验动物中心（三水基地），实验动物许可证号SCXK（粤）2014-0035，体质量1.8～2.2 kg。

成熟乳（1 月左右的混合母乳）来源于北京大学医学部，采集于北京地区的母亲。

磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、 2-巯基乙醇（均为分析纯）、碳酸氢铵（分子生物级） 天津科密欧试剂有限公司；碘乙酰胺、二硫苏糖醇、四甲基乙二胺（均为分子生物级），乙腈、甲酸（均质谱级），十二烷基硫酸钠（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司；甘氨酸（分析纯） 德国Biofroxx 公司；三羟甲基氨基甲烷（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶（质谱级） 美国Sigma公司； 甲酸（质谱级） 梯希爱化成工业发展有限公司；ProteinA/G agarose（分析纯） 上海翊圣生物科技有限公司；CNBr-活化的Sepharose 4B（分析纯） 上海信帆生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

ProteoMiner 低丰度蛋白富集试剂盒、电泳仪 Bio-Rad中国公司；LTQ Orbitrp Velos质谱仪 美国Thermo Fisher公司；LC-20A高效液相色谱 日本岛津有限公司；5810R台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司；MDF-192超低温冰箱 松下电器（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 母乳多克隆抗体的制备

将母乳在4 ℃、10 000 r/min离心20 min，除去上层的脂质层，收集其乳清部分并与完全福氏佐剂乳化（终质量浓度4 mg/mL），对白兔进行皮下多点注射（免疫剂量为1.25 mg/mL），在初次免疫后的第4、6、8周分别以等量的抗原与非完全福氏佐剂乳化，加强免疫后的第10天取血测效价，当效价达到105以上时，心脏取血，得到的兔血在37 ℃水浴中静置30 min，然后在4 000 r/min离心30 min，吸取上清液，分装冻存于-80 ℃冰箱中[19]。

1.3.2 母乳多克隆抗体的纯化

将血清从-80 ℃取出，待样品溶解后，过0.22 μm的聚醚砜滤膜过滤，收集过滤后的滤液。取1 mL左右的Protein A/G agarose填料装入层析柱中，先用5～10 倍柱体积的洗涤缓冲液（0.15 mol/L氯化钠、20 mmol/L磷酸二氢钾）洗去残存的乙醇。将过滤后的血清反复上柱孵育，接着用洗涤缓冲液（0.15 mol/L氯化钠、20 mmol/L磷酸氢二钠）洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液（0.1 mol/L甘氨酸）洗脱抗体[19]。

1.3.3 母乳免疫亲和层析

将纯化的抗体在偶联缓冲液（0.1 mol/L碳酸氢钠，pH 8.3）中4 ℃透析并与CNBr-活化的Sepharose 4B偶联装柱。向得到的母乳乳清中加入蛋白酶抑制和氯化钙溶液，将乳清中氯化钙浓度调整成0.06 mol/L，用盐酸将样品的pH值调至4.6[20]，样品在室温下孵育1 h。然后4 ℃、13 000×g离心30 min，重复1 次，收集上清液过0.22 µm滤膜，样品在室温下孵育30 min过柱，以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤出大部分未与抗体结合的乳清蛋白，收集此阶段的溶液作为去除高丰度蛋白的母乳，再用PBS溶液充分洗涤免疫亲和柱，待基线洗平时，用pH 2.4 0.1 mol/L的甘氨酸溶液洗脱与抗体结合的乳清蛋白，然后平衡及再生免疫亲和层析柱[21]。将收集到的样本透析到PBS内，并对样本用PEG20000包埋浓缩。浓缩完成后进行十二烷基硫酸钠-聚丙酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，验证免疫亲和层析的效果。

1.3.4 ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒处理

母乳样本经过冻干、复溶，使样品中蛋白质的质量浓度达50 mg/mL以上，参照说明书操作，收集此阶段的液体，所得到的滤液经SDS-PAGE验证效果。

1.3.5 SDS-PAGE分析

每个样本取12 μL，加入3 μL的5 倍体积上样缓冲液，旋涡混匀，在沸水中水浴5 min，10 000×g离心5 min，取上清液，每孔上样10 μg蛋白。进行10%的分离胶SDS-PAGE，设置电泳仪恒流30 mA，时间30 min，电泳完成后，振荡染色30 min，脱色至背景透明，进行凝胶成像仪拍照。

1.3.6 乳清蛋白液相色谱-质谱分析的前处理

将脱色好的胶先用500 mL乙腈脱水，风干乙腈，加入2 倍体积10 mmol/L二硫苏糖醇溶液，56 ℃水浴1 h，冷却吸干，加入55 mmol/L碘乙酰胺避光45 min，清洗脱水，加入胰蛋白酶液，4 ℃静置30 min，再37 ℃孵育过夜。加入5 倍体积50%乙腈溶液，5 000×g离心1 min，将上清液移至离心管中，重复2 次，真空冷冻干燥。抽干的肽段样品用2%乙腈-0.1%甲酸溶液复溶，4 ℃、25 000×g离心20 min后，取上清液进样分析。

1.3.7 仪器测定条件

液相色谱分离：通过L C-2 0 A 高效液相色谱仪进行分离。样品首先进入trap柱富集并除盐，随后与自装C18柱（15 cm×75 μm，3.6 μm）串联，以300 nL/min流速通过如下有效梯度进行分离：流动相A（2%乙腈-0.1%甲酸溶液）、流动相B（98%乙腈-0.1%甲酸溶液），0～8 min，95% A、5% B；8～43 min，92%～65% A、8%～35% B；43～48 min，6 5%～4 0% A、3 5%～6 0% B；4 8 ～5 0 m i n，40%～20% A、60%～80% B；50～55 min，20% A、80% B；55～65 min，95% A、5% B。纳升液相分离末端直接连接质谱仪[22-23]。

质谱检测：经过液相分离的肽段通过nano电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）源离子化后进入到串联质谱仪LTQ Orbitrap Velos进行数据依赖性采集模式检测。主要参数设置：nano离子源电压设置为1.8 kV。一级质谱扫描范围m/z350～1 500，分辨率设置为30 000；二级质谱起始m/z固定为100，分辨率设置为7 500。进行二级碎裂的母离子筛选条件为：电荷2＋、3＋和4＋以上，峰强度超过1 000并且排在前12的母离子。高能碰撞解离碰撞能量设置为35，碎片离子在Orbitrap中进行检测。动态排除时间设定为15 s。自动增益控制设置为：一级1×106，二级5×104[24]。

1.3.8 质谱数据分析

使用Homo sapiens基因组作为参考，Mascot v2.3.02进行搜库鉴定，参数见表1。使用DAVID软件进行Gene Ontology（GO）功能注释分析、Pathway途径分析和Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）分析[25-26]。

表1 Mascot搜索参数Table 1 Mascot search parameters

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE分析

如图1所示，抗体血清经过Protein A/G agarose纯化后，血清中除特异性免疫球蛋白（主要是IgG）以外的多种无关蛋白被去除，在25 kDa和50 kDa出现对应的IgG轻链和重链，纯化效果较好。经过免疫亲和柱处理后的样品在对应的蛋白条带有所减弱，说明免疫亲和柱能在一定程度上去除高丰度蛋白，洗脱部分也有对应的蛋白条带。ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒处理样本的SDSPAGE如图1所示，经过ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒处理后，35～70 kDa之间有多条新的条带显现出来，同时在10、25、170 kDa相对应的条带变浅，上述结果表明ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒不仅能富集一些低丰度蛋白，同时能在一定程度上去除高丰度蛋白，试剂盒处理效果较好。

图1 不同处理后的母乳乳清蛋白的SDS-PAGE图Fig. 1 SDS-PAGE profiles of breast milk whey proteins with different treatments

2.2 质谱检测结果

将母乳样品分别经过免疫亲和层析和低丰度蛋白富集试剂盒前处理，除去部分高丰度蛋白，最后经过LTQ Orbitrp Velos质谱仪检测，如图2所示，免疫亲和层析法鉴定49 种蛋白质，ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒鉴定出172 种蛋白质，2 种方法总共鉴定186 种蛋白质，其中有49 种蛋白质在母乳中鲜有报道。

图2 2 种方法乳清蛋白的Venn图Fig. 2 Venn diagram showing shared and unique whey protein components identified by the two methods

2.2.1 母乳乳清蛋白的GO注释分析

对蛋白质功能性质的研究有助于提高对乳蛋白质的利用和认识[27]。为进一步认识母乳中的乳清蛋白质，将鉴定的186 种蛋白质进行GO注释分析，分别对其细胞成分、生物途径以及分子功能3 个方面的信息进行归类[28]。 如图3所示，在母乳的乳清蛋白中，13.04%集中在细胞部分、11.96%在细胞外区域、13.22%在细胞器、8.24%在膜部分；蛋白参与了很多生物途径，其中有8.5%的蛋白参与生物调节、9.04%的蛋白参与代谢过程，10.95%的蛋白参与细胞过程，7.12%的蛋白参与本土化过程，其余蛋白分别参与了信号、刺激性反应、生物黏附等；母乳乳清中这些蛋白的分子功能主要是结合活性和催化活性，分别占蛋白的43.82%和27.21%，还有分子功能调节、分子传感器活性等多个功能。

图3 母乳乳清蛋白的GO注释图Fig. 3 GO functional annotation analysis of breast milk whey proteins

2.2.2 母乳乳清蛋白的Pathway分析

为更进一步了解母乳乳清蛋白的代谢路径，采用DAVID在线分析平台对母乳乳清蛋白进行Pathway分析。如表2所示，有181 个蛋白被识别，其中有12.71%的蛋白参与代谢途径，有12.15%的蛋白参与PI3K-Akt信号通路，有12.15%的蛋白参与吞噬代谢途径，有8.84%的蛋白参与磷脂酶D信号通路等，其余代谢路径包括：癌症中的转录失调、病毒性心肌炎、扩张型心肌病等，共有201 个代谢路径。

表2 母乳乳清蛋白参与最多的13 个通路Table 2 Top 13 pathways in which breast milk whey proteins most participate

Pathway分析结果进一步说明，已经注释功能的蛋白质可能参与婴幼儿某种疾病发生的多种代谢途径。

2.2.3 母乳乳清蛋白的COG分析

为更加清楚地了解母乳乳清蛋白质的功能，将鉴定到的186 种蛋白质和COG数据库进行比对，预测这些蛋白质可能的功能并对其做功能分类统计。如图4所示，有19 种蛋白质属于碳水化合物的运输和新陈代谢类蛋白，有13 种蛋白质属于仅通用功能预测，有5 种蛋白质属于信号转导机制类蛋白，有4 种蛋白质属于防御机制类蛋白等，其余功能分类有：能源生产和转换、氨基酸转运和代谢、核苷酸转运和代谢等。上述结果表明，在1 月的母乳中，相关蛋白主要在碳水化合物的运输和新陈代谢、功能预测、信号转导等过程中起调控作用。

图4 母乳乳清蛋白的COG分类Fig. 4 COG classification of breast milk whey proteins

3 讨 论

本实验以1 月左右的成熟乳为实验材料，通过免疫亲和层析和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒2 种前处理方法除去部分高丰度蛋白，采用LTQ Orbitrp Velos质谱仪检测，并进行相关生物信息学分析。

免疫亲和层析处理和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒处理都有去除部分高丰度蛋白效果，但是试剂盒的效果较好，这可能与制备的抗体有关。本实验是由分离脂肪的母乳作为抗原，然后制备得到多克隆抗体，通过免疫得到的抗体在制备免疫亲和柱之后能洗脱对应的蛋白，说明母乳中的酪蛋白、乳铁蛋白、分泌性IgA以及α-乳白蛋白具有免疫原性，使动物产生了抗体，但是抗体产生与免疫原和免疫剂量有关，微量的低丰度蛋白依然存在产生相应抗体的可能，这些抗体的存在会导致其他蛋白的损失。根据已有的文献，Holland等[18]利用半胱氨酸标签法移除了αs1-酪蛋白和β-酪蛋白；杨梅[29]利用等电点的方法去除酪蛋白。本实验的2 种方法除了去除酪蛋白以外，可能还去除了其他高丰度蛋白，对鉴定低丰度蛋白可能具有更大意义。

通过质谱检测，免疫亲和层析法处理后鉴定出49 种蛋白质，ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒处理后鉴定出172 种蛋白质，2 种方法共鉴定出186 种蛋白质。Panchaud等[30]采用分子过滤法和阴离子交换色谱柱富集了人乳中一些低丰度表达蛋白质，随后利用SCX/RP进行分级，最终在乳清中定性了43 种蛋白质；Liao Yalin等[3]利用蛋白富集试剂盒处理母乳，然后基于1D-LC的蛋白质组学方法分离得到115 种蛋白质；Molinari等[31]利用蛋白富集试剂盒处理母乳，然后利用SDS-PAGE、荧光差异双向电泳、一维基质辅助激光解吸电离、二维基质辅助激光解吸电离、同位素标记相对和绝对定量技术鉴定出415 种蛋白质。由于本实验主要是比较2 种前处理方法除去高丰度蛋白、富集低丰度蛋白的效果，并通过蛋白质组学技术探索母乳中的重要活性蛋白，而不是单纯为了利用同位素标记相对和绝对定量等技术去鉴定到更多的蛋白数，所以鉴定到的蛋白数有限。另外，Shen Yunfeng等[32]发现免疫亲和层析技术在血清蛋白鉴定中会丢失一些低丰度的蛋白，这可能是这些蛋白与对应的基质发生非特异性结合；Molinari等[31]发现用ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒母乳样品之后，一些中等丰度的蛋白质可能对六肽配体文库具有非常低的结合亲和力，并且不保留在ProteoMiner珠子上，实际上，蛋白质对ProteoMiner肽文库的不同结合亲和力已经被描述为该技术的主要限制之一，估计任何给定混合物中5%～15%的蛋白质可能完全没有结合[33]。在蛋白质组学的研究中，任何一种方法不能完全发现目标物内的所有蛋白，只要该方法有促进蛋白质的发现并能与之前的方法相互补充，就有一定的研究意义。

参考已报道的文献[3,19,31]，可能有49 种蛋白质未在母乳中检测出。其中免疫球蛋白占18%，这表明人乳在保护婴儿免受感染中起着至关重要的作用，尽管有大量文献描述了母乳喂养对婴儿的保护作用，但其机制还未阐明[34]。有14%的蛋白质具有促进生长发育的作用，如有丝分裂检查点丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对于纺锤体装配检查点信号传递和正确的染色体对齐至关重要[35]；Ras GTPase激活样蛋白，在调节肌动蛋白细胞骨架的动力学和组装中起关键作用，可能促进神经突生长[36]。还有14%的蛋白质目前鲜有报道。这也说明了本研究采用的免疫亲和技术和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒2 种前处理方法均具有一定分离出新蛋白的优势。

人乳中的某些蛋白质可用作炎症和疾病的标志物。一些研究报道了乳腺炎期间免疫蛋白水平的变化，在乳腺炎发作期间，乳铁蛋白、sIgA、分泌性白细胞蛋白酶抑制剂和血清白蛋白都被发现在人乳中存在较高水 平[37-38]。关于牛奶的研究也发现了许多免疫蛋白[39]，在本研究鉴定的蛋白质中，有15 种与肠道免疫网络途径相关，有22 种与吞噬途径相关，有20 种与结核途径相关等，这些都可能具有作为某些炎症和疾病的标志物的潜力。

综上所述，免疫亲和技术和ProteoMiner低丰度蛋白富集试剂盒可以增加蛋白质被检测到的几率，通过对这些蛋白质的研究，揭示母乳中有很多有生物活性的蛋白值得进一步探索，母乳喂养有不可替代的优势，并对配方奶粉的改进有重要意义。