万慧婷,吴琳,赵秀芬,钱军,袁杨刚,邢昌赢

江苏省人民医院，南京210029

IgG类自身抗体具有高亲和力，参与细胞清除、细胞受体效应等，往往反映病理过程。多数参与自身免疫病的自身抗体是IgG型。自身抗体与游离分子反应形成病理性抗原一抗体免疫复合物，通过激活补体产生炎症。根据IgG分子重链恒定区的不同可将其分成IgG1、IgG2、IgG3、IgG4四种亚型，它们具有不同的结构和生物学特点[1]。IgG4亚型测定在病因鉴别、疾病特点分析及转归中有重要价值。在不同的肾脏病中，肾组织沉积的IgG亚型不尽相同。根据IgG亚型肾小球免疫荧光强度评分及血清IgG抗体浓度测定发现，在狼疮性肾炎(LN)中，IgG1、IgG2、IgG3均有沉积[2]，然而在不同病理类型的LN中IgG亚型在肾小球的沉积特点研究较少。本研究拟分析不同病理类型的LN中IgG亚型在肾小球的沉积特点并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年5月～2016年10月于南京医科大学第一附属医院肾内科或风湿免疫科住院的SLE患者，其诊断符合美国风湿病学会(ACR)1997年制定的SLE诊断标准，均经肾活检病理诊断为LN，排除标准：①合并肿瘤；②合并严重感染。入选病例共61例，男10例、女51例，年龄17～66(35.8±13.3)岁。按照 WHO标准进行肾小球病变的病理分型[3]，Ⅱ型4例，Ⅲ型6例，Ⅳ型23例，Ⅴ型28例。24小时尿蛋白为2.6(1.3,4.6)g，血清白蛋白(25.7±7.6)g/L，血清肌酐68.9(52.9,109.5)μmol/L，血清尿素(8.19±5.12)mmol/L，肌酐清除率(Ccr)为(104.98±68.33) mL/min，肾小球滤过率(eGFR)为(91.03±38.18)mL/min·1.73 m2，血清IgG为11.5(7.7,15.9)g/L，血清C3为0.46(0.31,0.69)g/L，血清C4为0.07(0.064,0.12)g/L。

1.2 IgG亚型的测定 采用常规直接免疫荧光法进行抗体染色。FITC标记的小鼠抗人单克隆抗体IgG1(ab99772)、IgG2(ab99788)、IgG3(ab99827)、IgG4(ab99821)均购自美国Abcam公司。冰冻切片吹干，冷丙酮固定，PBS洗涤，10% BSA封闭30 min，PBS 洗涤，滴加抗体，小鼠抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4均以1∶150稀释，37 ℃孵育1 h。PBS冲洗，吹干，甘油封片，荧光显微镜观察。半定量记录荧光强度，由阴性到最强，计为0～++++，阴性的阳性强度计为0；低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见为+，阳性强度计为1；低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见为++，阳性强度计为2；低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼为+++，阳性强度计为3；低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼计++++，阳性强度计为4，计算阳性强度平均值。

2 结果

2.1 IgG亚型的免疫荧光染色结果 83.6%的病例IgG1、IgG2、IgG3均有阳性染色，且阳性相对较强，沉积部位主要在肾小球基底膜上皮下，少量在系膜区和肾小管上皮有沉积。IgG4较前三个亚型沉积少，且程度较弱。61例LN患者中IgG1阳性表达54例，阳性率88.5%，IgG2阳性表达56例，阳性率91.8%，IgG3阳性表达53例，阳性率86.8%，IgG4阳性表达25例，阳性率40.9%。IgG1、IgG2、IgG3、IgG4阳性强度分别为2.06、2.09、2.36、0.65。IgG1、IgG2、IgG3的阳性率及阳性强度间无统计学差异，IgG1、IgG2、IgG3与IgG4的阳性率、阳性强度比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。Ⅱ型4例，其中IgG1、2、3、4的阳性率分别为75.0%、75.0%、75.0%、25.0%；阳性强度分别为1.50、1.50、2.00、0.25。Ⅲ型6例，其中IgG1、2、3、4的阳性率分别为50.0%、50.0%、50.0%、0%；阳性强度分别为1.17、1.00、1.50、0。Ⅳ型23例，其中IgG1、2、3、4的阳性率分别为100.0%、100.0%、95.6%、47.8%；阳性强度分别为2.43、2.43、2.74、0.78。Ⅳ型23例，其中IgG1、2、3、4的阳性率分别为100.0%、100.0%、95.6%、47.8%；阳性强度分别为2.43、2.43、2.74、0.78。Ⅴ型28例，其中IgG1、2、3、4的阳性率分别为89.2%、96.4%、85.7%、46.4%；阳性强度分别为2.03、2.14、2.21、0.79。由于Ⅱ型和Ⅲ型样本量太少，将两者合并统计，结果IgG1、IgG2、IgG3在各病理类型间的分布均无统计学差异，Ⅳ型/Ⅴ型的IgG4阳性率大于Ⅱ型和Ⅲ型(P<0.01),而Ⅳ型和Ⅴ型间无统计学差异。

2.2 各IgG亚型与病理指标强度间的关系 IgG1与IgG、C1q呈正相关(ρ分别为0.271、0.272,P均<0.05)；IgG2与C1q呈正相关(ρ=0.276,P=0.031)；IgG3与C1q、C3呈正相关(ρ分别为0.540、0353,P均<0.05)。IgG4与各病理指标间均无相关性(P均>0.05)。

2.3 IgG亚型与疾病活动度的关系 IgG1与SLEDAI评分呈正相关(ρ=0.351,P=0.006)，与血清C3、C4呈负相关(ρ分别为-0.330、-0.365,P均<0.05)；IgG2与SLEDAI评分呈正相关(ρ=0.395,P=0.002)，与血清C3、C4呈负相关(ρ分别为-0.382、-0.343,P均<0.05)；IgG3与SLEDAI评分呈正相关(ρ=0.273,P=0.033)，与血清C3、C4呈负相关(ρ分别为-0.542、-0.495,P均<0.05)；IgG4与eGFR呈负相关(ρ=0.258,P=0.048)。

2.4 IgG亚型间的相互关系 IgG1与IgG2、IgG3呈正相关(ρ分别为0.679、0.557,P均<0.001)，IgG2与IgG3(ρ=0.506,P<0.001)呈正相关，IgG4与其他三种亚型间均无相关性(P均>0.05)。

3 讨论

IgG是人体血清免疫球蛋白的主要成分，分为 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 4个亚类，它们具有高度的同源性，又有不同的理化特性，参与免疫反应的途径及生物学活性各不相同，在多种疾病的发生过程中发挥重要作用。IgG四种亚型各自不同的结构特点决定了它们不同的生物学活性。如IgG1、IgG2和IgG3与抗原形成免疫复合物通过经典途径激活补体，而IgG4则发生聚合通过替代途径激活补体。在IgG介导的自身免疫病中，主要是IgG1和IgG3型自身抗体占优势，广泛参与疾病的免疫病理过程。但实际上，对于大多抗原的免疫应答均有4种亚型的共同参与，在诸多自身免疫病中可发现IgG4型自身抗体。至于它们如何协同发挥免疫作用目前尚不清楚。

IgG亚型在SLE发病机制中的作用越来越引起研究者的重视。SLE是最常见的自身免疫性疾病，表现为产生多种自身抗体以及多脏器受累，其中LN是SLE最常见且严重的并发症。对SLE患者血清自身抗体的IgG亚型研究中发现，IgG1、IgG2、IgG3型主要参与了SLE的病理机制[4]。在对狼疮肾病的研究中，多数研究者认为IgG1、IgG2、IgG3在肾小球中均有沉积，而IgG4无沉积或强度不如前3者[5,6]。最近一项大规模的IgG 亚型研究包含了307例LN，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型均表现出以IgG1、IgG2、IgG3阳性为主，IgG4沉积很少且荧光强度低的表型，IgG亚型的分布在Ⅰ/Ⅱ系膜型与Ⅲ/Ⅳ增殖型之间无统计学差异。对于Ⅴ型LN，IgG1、IgG2、IgG3的表达同样丰富，同时IgG4的表达明显多于前几种病理类型[7]。国内研究者在肾小球IgG亚型分布方面主要比较特发性膜性肾病及继发性膜性肾病中4种IgG亚型的分布。其中在狼疮膜性肾病中，IgG1、IgG3、IgG4三种亚型均有沉积(IgG2未做)，IgG4较少沉积且强度显著低于其他亚型，结果与国外一致[8]。但在另一项研究中，狼疮膜性肾病中IgG亚型的分布与前述不同，IgG1的阳性率仅为22.5%，IgG2和IgG3阳性率较高，分别为67.5%和57.5%，IgG4则显著不同，40例标本均为阴性[9]。

本研究通过对LN的肾活检样本行IgG亚型检测发现，IgG1、IgG2、IgG3均有大量沉积，其中IgG1阳性率88.5%，IgG2阳性率91.8%，IgG3阳性率86.8%，三者荧光强度无统计学差异，但阳性强度相互之间均呈线性相关。IgG4阳性率最低，为40.9%，均伴有其他亚型抗体同时沉积，未见IgG4单独沉积，其强度与其他三种亚型无相关性。由此可见，在IgG介导的肾损害中IgG1、IgG2、IgG3可能发挥主要作用，且存在协同效应共同介导LN的发病，而IgG4阳性率及强度低于其他亚型且与其他亚型之间无相关性，提示IgG4与其他几种IgG亚型的免疫途径不同，可能是以单独途径参与免疫反应的。对于不同病理类型的IgG亚型分布特点，可观察到Ⅳ型及Ⅴ型的IgG4表达明显高于Ⅱ型和Ⅲ型，IgG1、IgG2、IgG3型的表达与总体特征一致。

不同的IgG亚型其物理化学性质及免疫机制各不相同，如补体结合能力，所以在免疫复合物沉积在肾组织后所引起的损伤也是不同的。我们对各个IgG亚型与病理指标及临床指标之间的相关性进行了分析，结果显示，IgG1、IgG2、IgG3均与C1q呈正相关，表明这三个亚型均能激活补体，C3仅与IgG3呈正相关，可能与IgG3的分子结构相关。由于其铰链区有62个氨基酸，分子柔性最大，故能最有效地激活补体[10]。另IgG3与C1q的相关系数比与C3的相关系数更大，表明IgG对LN的肾组织损伤主要激活经典途径，且亚型以IgG3为主。临床指标方面，IgG1、IgG2、IgG3均与SLEDAI评分呈正相关，与血清C3和C4呈负相关，其中以IgG3与血清C3和C4的相关系数最大，分别为-0.542和-0.495，这一结果表明IgG1、IgG2、IgG3三个亚型均与LN的活动性有关，且以IgG3最为相关，与前述IgG3分子能最有效激活补体的能力一致。另外，IgG4与eGFR呈负相关，说明IgG4的沉积对肾小球的滤过功能造成了不利影响。

综上所述，四种IgG亚型在LN患者肾小球中均有沉积，IgG1、IgG2、IgG3呈强分布，IgG4阳性率及荧光强度比前三者少。IgG1、IgG2、IgG3三者呈正相关且均与LN活动性相关指标有一定关系，与IgG4无相关性；LN的致病机制可能经IgG1、IgG2、IgG3联合途径及IgG4独立途径的免疫反应参与。但由于样本量较小，且未测定患者血清中IgG亚型的浓度，本研究有一定局限性，今后可扩大样本量，通过对患者随访观察，动态监测患者血清IgG亚型水平，进一步评价不同IgG亚型沉积对疾病转归及远期预后的临床意义。