刘博文，潘丽慧，曹旭晨

天津医科大学肿瘤医院乳腺肿瘤一科,国家肿瘤临床医学研究中心,天津市肿瘤防治重点实验室,天津市恶性肿瘤临床医学研究中心,乳腺癌防治教育部重点实验室,天津300060

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，术后出现的治疗抵抗、复发及转移是我们面临的主要挑战[1]，因此深入了解其调控机制有重要意义。miRNA是一类内源性、高度保守的短链非编码RNA，其对基因表达有负调控作用，部分miRNA还可作为转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路的下游信号分子发挥作用。上皮—间充质转化(EMT)可介导肿瘤转移，在肿瘤的恶性转化中起重要作用，但该过程受TGF-β/Smad信号通路所调控。此外，有研究表明miRNA、TGF-β相关信号通路及EMT过程在乳腺癌细胞的干性调控中亦发挥重要作用[2,3]。现对miRNA、TGF-β信号通路及EMT过程在乳腺癌细胞及其干性、肿瘤微环境中的相互调控作用综述如下。

1 miRNA 对乳腺癌的调控作用

miRNA是小的非编码单链RNA，长为19～25个核苷酸，最新的miRBase数据库已注册了1193个小鼠miRNA基因和1881个人类的miRNA基因。经严格筛选，小鼠和人体内确定的标准miRNA基因数量分别为475和519。miRNA对其靶mRNA的识别主要通过miRNA与靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)的互补序列结合来介导。有研究表明，miRNA可在组织发育中呈差异性和暂时性表达[4]。在肿瘤学研究中，有学者发现，不同的miRNA特征可准确分辨肿瘤和肿瘤的不同亚型[5]。此外，miRNAs还可作为肿瘤诊断和治疗的候选标志物，耿淼等[6]研究发现，低表达 Let-7g 的三阴性乳腺癌(TNBC)患者预后更差，提示Let-7g可作为TNBC患者治疗和预后评价潜在的分子靶点。据报道，诸多miRNA可抑制不同的肿瘤相关基因，即扮演癌基因和抑癌基因的角色[7]。如miRNA-29在乳腺癌中因可通过抑制抑癌基因DNA甲基化，被证明是一种抑癌因子，从而导致癌细胞增殖减少和药物敏感性增加[8]。而Liu等[9]证明，miRNA-29b的表达促进了人乳腺癌细胞的迁移和侵袭，miRNA-29b基因具有靶向肿瘤抑制因子 PTEN的能力。换言之，miRNA-29在乳腺癌的发生发展中既是抑癌因子亦是促癌因子。

2 TGF-β信号通路对乳腺癌的调控作用

TGF-β家族由三种TGF-β亚型、激活素、抑制素、骨形成蛋白(BMPs)、生长和分化因子组成。大致可分为TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS两个亚家族。具有调节癌细胞增殖、分化、迁移、黏附、凋亡、胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等重要作用[10]。TGF-β家族的配体与两种丝氨酸—苏氨酸激酶受体(Ⅱ型和Ⅰ型受体:TβR-Ⅱ和TβR-Ⅰ)结合后，特异性复合物被激活以传导下游信号。TGF-β可激活Smad依赖的信号传导通路，其中TGF-β亚型和激活素可触发Smad2和Smad3的磷酸化(激活素/TGF-β特异性R-Smads)。BMP可触发Smad1、Smad5和Smad8的磷酸化(BMP特异性R-Smads)。此外TGF-β还可激活几种Smad非依赖的信号传导途径，如PI3K-Akt信号通路和MAPK通路等非Smad信号通路。TGF-β在肿瘤发生发展中的作用主要体现在以下方面[11]：①生长调节，特别是在肿瘤发生的早期阶段摆脱TGF-β的生长抑制；②在肿瘤微环境中通过TGF-β增强细胞外基质的合成和纤维化；③通过TGF-β促进EMT和(或)转移；④肿瘤微环境的免疫抑制作用。TGF-β在乳腺癌中扮演双重角色，其不仅是一种抑癌因子，还可促进乳腺癌的浸润及转移。TGF-β2失活提高了癌前病变或分化较高的乳腺癌细胞侵袭力，但亦下调了分化较差恶性程度较高的乳腺癌细胞的转移能力[12]。

3 EMT过程对乳腺癌的调控作用

肿瘤细胞的EMT是指由极化的稳定的上皮细胞转变为不稳定的间充质细胞，从而使其侵袭转移能力增强。这种转化的特征是降低促进细胞之间接触蛋白质(如E-钙黏蛋白和γ-连环蛋白)的表达，增强间充质标志物(如波形蛋白，N-钙黏蛋白和纤维粘连蛋白)的表达，同时亦可增强部分基质金属蛋白酶的活性。EMT可分为发育型(Ⅰ型)、纤维化和伤口愈合型(Ⅱ型)和肿瘤型(Ⅲ型)。最新研究表明，EMT在肿瘤侵袭和转移中起关键作用，EMT能使肿瘤细胞发生早期转移，发生EMT的肿瘤细胞可脱离原发肿瘤，穿过基底膜进入循环外周血，然后再逆转为上皮表型并形成肿瘤的远处转移病灶[13]。既往研究不断肯定肿瘤微环境(TME)在调节肿瘤细胞EMT中的重要性，如缺氧、细胞外基质组成的改变及其生物学特性亦决定了肿瘤细胞对TGF-β的反应及其驱动EMT过程和转移进展的能力[14]。有研究表明，EMT相关基因的表达与基底样型乳腺癌相关，包括转录因子FOXC2等。基底样型乳腺癌远处转移能力强、预后差，高表达EMT相关蛋白(波形蛋白、仅平滑肌肌动蛋白、N-钙黏蛋白、钙黏蛋白-1 )、层黏连蛋白、肌成束蛋白，低表达E-钙黏蛋白[15]。

4 乳腺癌中miRNA、TGF-β信号通路及EMT过程的相互调节机制

有研究证实，miRNA可通过靶向TGF-β信号传导途径的下游靶点，在多个水平调控TGF-β信号[16]。目前在肿瘤中已发现了多种靶向TGF-β受体的miRNA，包括miR-21、miR-17/92、miR-106b、miR-211及miR-590等[17]。反过来，TGF-β/BMP信号传导通路可调控多种miRNA，从而形成反馈调节。如TGF-β信号传导途径可上调miR-21、miR-181、miR-10b、miR-17/92、miR-155、miR-192、mir-23/24/27、miR-216/217、miR-494和miR-182的表达[16]；下调miR-200、miR-203、let-7、miR-34a和miR-584的表达[18]。国内外多项研究表明，部分miRNAs可直接靶向EMT转录因子从而调控EMT。如miR-205和miR-200协同作用可通过抑制ZEB从而抑制EMT[19]。有部分miRNA通过靶向细胞结构组分调节EMT。CDH1是调节肿瘤上皮细胞之间黏附、运动的钙依赖蛋白，在人类乳腺癌细胞中，miR-194的过表达可直接抑制CDH1从而抑制EMT过程。

TGF-β、血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、NF-κB、Wnt、Notch和hedgehog蛋白等信号通路及重要因子可直接或间接促进Snail、ZEB1/2和NF-κB等转录因子的表达，抑制细胞上皮表型的基因表达，促进EMT，我们将这些转录因子称为“EMT的激活剂”[20]。如TGF-β与其受体(TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ和TGF-βRⅢ)相结合后会使Smad 2和Smad3磷酸化，并与Smad4形成复合体，之后该复合体转入核内，在核内进一步调控TGF-β靶基因及其他DNA结合因子的表达，如Snail、ZEB和 Twist基因等,结果造成上皮标志物表达下调及间充质标志物表达上调[21]。Zhang等[22]在前期研究中发现,FAM64A可促进乳腺癌的EMT过程，进而促进细胞的侵袭及运动，同时在乳腺癌细胞干性的维持中也发挥着重要作用，但FAM64A对EMT的具体调控机制需要进一步研究。TGF-β诱导EMT的具体过程可分为两步，第一步，上皮细胞转化为部分EMT状态，同时SNAIL-miR-34双稳态开关被激活，这导致E-钙黏蛋白的表达降低和波形蛋白的表达增加。第二步，细胞从部分EMT状态转变为间充质状态，并且ZEB1-miR-200双稳态开关被激活，这导致E-钙黏蛋白的表达降低和波形蛋白的表达增加[23]。

5 miRNA、TGF-β信号通路及EMT过程在乳腺癌微环境调节中的作用

miRNA不仅可调节肿瘤细胞的特性，还可调节肿瘤微环境从而促进肿瘤细胞转移、治疗抵抗及免疫抑制[24]。癌细胞中miRNAs改变可通过改变癌细胞分泌的因子产生对癌细胞有利的微环境，TGF-β能上调miR-21和miR-155来促进MDSCs的产生[25]。有学者提出TGF-β相关的miRNAs可调节TGF-β诱导的癌症相关成纤维细胞的形成， TGF-β诱导型miR-21可靶向Smad7并潜在促进TGF-β诱导的肿瘤形成[26]。TGF-β通过抑制成纤维细胞的活性而抑制肿瘤细胞的活性，肿瘤相关成纤维细胞中TGF-β信号通路的丧失能够促使驱动肿瘤形成和转移进展的微环境因子的产生。在乳腺成纤维细胞中选择性删除TβR-Ⅱ基因表达后也可观察到乳腺癌形成，其机制是通过增加成纤维细胞分泌的细胞因子和生长因子(如TGF-β、MSP和HGF)来改变细胞外基质的生物学特点，从而增强乳腺癌细胞的增殖和侵袭。

整合素是有致癌效应的TGF-β信号传导的突出介质及并且其与EMT密切相关。整合素是将细胞外基质与肌动蛋白细胞骨架系统连接起来的跨膜支架，它们还可作为机械转导的介质，调节细胞增殖、迁移和侵袭。其中，整合素对TGF-β反应性的表达上调对于EMT至关重要。整联蛋白通过FAK桥接与TβR-Ⅱ形成复合物，导致Src介导的Tyr284的TβR-Ⅱ磷酸化，后者可募集将TGF-β与p38MAPK的扩增活化相耦合所必需的ShcA和Grb2[27]。抑制这些关键因子可抑制致癌的TGF-β信号传导，包括其与NF-κB、Cox-2和PGE2信号途径的偶联，以及阻止TGF-β驱动的EMT和转移表型的获得。TGF-β信号通路还受其与整合素的物理相互作用的影响，整合素亦可调节EMT过程及p38 MAPK信号通路中的TGF-β的激活。最近，国内外专家学者将EMT中的TGF-β刺激与播散性乳腺癌细胞增殖及转移相联系，改变TGF-β激活Smad4的复杂的肿瘤微环境，从而阻断Pyk2(可介导癌细胞转移性休眠的逃逸)的表达[28]。但这些受E-cadherin和整合素的“倒数式”表达模式的控制，休眠细胞通常是E-钙黏蛋白高表达，整合素低表达，而成熟细胞通常是整合素高表达，E-钙黏蛋白低表达[29]。更为重要的是，EMT表型的获得代表了分子开关允许细胞在转移性休眠和生长之间切换，这是由于E-钙黏蛋白表达减少，其以异型方式与整联蛋白的细胞外结构域相互作用，导致整合素和Pyk2介导转移失活。最后，我们将“整联蛋白转换”定义为TGF-β致癌活性的新型调节剂。

6 miRNA、TGF-β信号通路及EMT过程在乳腺癌干细胞(CSCs)调控中的作用

CSCs是指像干细胞一样有自我更新分化能力的肿瘤细胞。但它们是否能分化成不同类型的细胞还存在争议。程腾等[30]通过构建乳腺癌干细胞裸鼠移植瘤模型发现，miR-429可降低乳腺癌干细胞的干性和体内成瘤能力,其可能是抑制乳腺癌转移和耐药的关键分子。研究表明，TGF-β在多种肿瘤中发现与化疗后肿瘤干细胞富集所引起的化疗耐药有关[31]。随后的研究表明，同样产生的EMT后细胞群也可呈现处某些间充质干细胞的特征。

综上所述，乳腺癌中miRNA、TGF-β、EMT间相互联系，三者对乳腺癌微环境及CSCs均有调控作用，它们间的联系是一个复杂的、严密调控的网络，其中CSCs是乳腺癌复发和转移的重要原因，亦是乳腺癌患者的主要死亡原因。因此深入了解各调控机制、发现新的miRNA功能及针对乳腺癌干细胞进行个体化治疗将会为乳腺癌的诊断、治疗及预后改善带来新的进展。