周凯妃，滕艳娟，陈似霞，唐雯帧，邱洁净，莫新少

广西医科大学第一附属医院，南宁 530021

原发性肝癌在我国常见恶性肿瘤中排第四位，在肿瘤致死病因中排第三位，其中肝细胞癌(HCC)占85%～90%[1]，广西是我国HCC的高发区之一。目前外科手术治疗仍是提高HCC患者生存率的主要方法。然而，肝切除手术创伤可出现肝功能损伤及肠道菌群紊乱加重[2]。近年来，随着对肠-肝轴认识的逐渐深入，肠道菌群与HCC间的联系越来越受重视[3]。健康状况下人体内肠道菌群存在一定的动态平衡，即微生态平衡，在维持人体健康方面起重要作用[4]，如果肠道菌群的平衡因各种因素遭到破坏，便会形成肠道菌群失调，表现为菌群的种类、定位、数量、比例及生物学特性方面的改变[5]。HCC伴随着不同程度的肠道菌群失调[6]，优势菌群在肠道内失去优势，对劣势菌群的拮抗作用降低，劣势菌群得以大量繁殖，产生过量的内毒素[7]，其主要活性成分脂多糖(LPS)通过激活肝Kupffer细胞，释放过量细胞因子损害肝细胞[8,9]。而肝细胞损伤时，窦周细胞如Kupffer细胞功能衰竭，可减弱对内毒素的清除作用[10]，由此形成加重肝细胞损伤的恶性循环。已有研究报道，肠道菌群的改变与酒精性肝病[11]、肝硬化[12]等慢性肝脏疾病的肝功能有关，但HCC手术急性应激引起的肠道菌群变化与术后肝功能间的关系尚不清楚。2019年3～11月，我们分析了HCC患者手术前后肠道菌群的变化，并探讨其与术后肝功能的关系，旨在为肠道菌群干预促进HCC术后肝功能的恢复提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年3～11月广西医科大学第一附属医院肝胆外科符合条件的HCC患者72例为研究对象。本研究得到广西医科大学第一附属医院伦理委员会的批准。患者均自愿参加本次研究并签署知情同意书。纳入标准：①年龄18～65岁；②术后病理确诊为HCC；③首次进行HCC切除术。排除标准：①有复发、转移或合并其他恶性肿瘤；②HCC破裂急诊手术；③入院前1个月内使用抗生素或益生菌制剂；④术前或术后未能收集粪便标本。

1.2 粪便标本收集 于术前及术后第5天收集粪便标本。嘱患者使用无菌粪便采集管留取粪便标本，并嘱咐患者留取中段粪便，并避免尿液的污染，然后将粪便标本放入装有冰袋的泡沫箱内。研究者尽快将标本送到实验室，分装成0.2 g/管后置入-80 ℃冰箱冻存备用。

1.3 肠道菌群检测 使用粪便基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，天根，DP328-02)提取粪便标本的总DNA，具体步骤按照说明书进行。本研究使用的引物参照文献[13，14]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。双歧杆菌正向引物：5′-GCGTGCTTAACACATGCAAGTC-3′，反向引物：5′-CACCCGTTTCCAGGAGCTATT-3′，扩增片段长度为126 bp；肠杆菌正向引物：5′-CATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC-3′，反向引物：5′-CTCTACGAGACTCAAGCTTGC-3′，扩增片段长度为195 bp。使用Applied Biosystems 7500对提取出来的粪便DNA进行扩增，扩增的细菌包括双歧杆菌和肠杆菌。用来扩增的荧光试剂是TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa, RR820A)，每一份PCR反应液(20 μL)包括TB GreenPremix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL、PCR Forward Primer(10 μmol/L)1 μL、PCR Reverse Primer(10 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、DNA模板2 μL、灭菌水5.6 μL。双歧杆菌扩增程序：预变性95 ℃(30 s),变性95 ℃(5 s),退火延伸60 ℃(34 s),40个循环，融解曲线步骤为仪器默认；肠杆菌扩增程序：预变性95 ℃(30 s),变性95 ℃(5 s),退火延伸59 ℃(34 s),40个循环，融解曲线步骤为仪器默认。引物的特异性通过扩增产物的融解曲线来确定。在每一次PCR扩增中均构建标准曲线并设置阳性对照、阴性对照。双歧杆菌和肠杆菌的质粒标准品由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。先检测标准品的浓度计算其DNA拷贝数，然后将质粒标准品5倍比8个梯度稀释后进行PCR扩增，以DNA拷贝数的对数值为横坐标，PCR扩增的结果CT值为纵坐标来构建标准曲线。最后，粪便样本中双歧杆菌和肠杆菌的拷贝数通过其标准曲线来定量。结果显示，扩增产物的融解曲线均呈单峰，表明引物具有高度特异性。根据扩增结果构建的标准曲线显示，双歧杆菌质粒标准品的斜率为-2.46，决定系数>0.99，扩增效率为92%；肠杆菌质粒标准品的斜率为-2.55，决定系数>0.99，扩增效率为88%，均达到定量标准。双歧杆菌/肠杆菌(B/E)>1表示肠道菌群的组成正常，B/E<1表示肠道菌群失调，而且B/E越低，提示肠道菌群失调越严重[5]。

1.4 肝功能检测 空腹抽取患者静脉血3 mL，使用日立7600全自动生化分析仪进行肝功能检测。术后第3、5天的肝功能指标包括总胆红素(TBiL)、直接胆红素(DBiL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)，肝功能指标由广西医科大学第一附属医院检验科进行检测，在医院HIS系统中收集。

2 结果

2.1 HCC手术前后肠道菌群比较 HCC手术前，双歧杆菌、肠杆菌相对丰度分别为log5(6.00±1.35)/g、log5(7.74±1.32)/g，B/E为0.80±0.22，双歧杆菌的相对丰度低于肠杆菌(t=-7.698，P=0.000)。HCC手术后，双歧杆菌、肠杆菌相对丰度分别为log5(5.65±1.26)/g、log5(8.14±1.02)/g，B/E为0.71±0.20，HCC手术后的双歧杆菌相对丰度、B/E相对于术前均降低(P分别为0.020、0.001)，而肠杆菌的相对丰度相对于术前升高(P=0.011)。

2.2 HCC手术前后肠道菌群失调发生率比较 HCC手术前肠道菌群失调(B/E<1)的发生率为81.9%(59/72)，术后升高到91.7%(66/72)，但手术前后肠道菌群失调发生率比较差异无统计学意义(P=0.092)。

2.3 HCC术后肠道菌群与肝功能的相关性分析 术后第3天，TBiL为(26.18±16.69)μmol/L，DBiL为(9.23±5.60)μmol/L，AST为(101.71±68.29)U/L，ALT为(188.92±153.10)U/L;术后第5天，TBiL为(25.63±16.46)μmol/L，DBiL为(9.80±7.56)μmol/L，AST为(54.32±91.83)U/L，ALT为(102.32±74.96)U/L，术后双歧杆菌与术后第3天和第5天的ALT呈负相关(r分别为-0.234、-0.264，P分别为0.048、0.025)。除此之外，HCC术后肠道菌群与肝功能其他指标之间无相关性(P均>0.05)。

3 讨论

健康人的肠道菌群主要由专性厌氧有益菌如双歧杆菌组成，拮抗兼性厌氧条件致病菌的定植，维持肠道菌群的平衡。在我们的研究中，HCC患者双歧杆菌的相对丰度明显低于肠杆菌的相对丰度，健康人的肠道菌群组成恰好相反，这与既往研究报道一致[15]。B/E包括了主要的专性厌氧有益菌——双歧杆菌和主要的兼性厌氧条件致病菌——肠杆菌，共同构成肠道的定植抗力[16]。因此，B/E可用来代表肠道菌群失调，当B/E<1时，表示肠道菌群失调,而且B/E越低，表示肠道菌群失调的程度越严重[5]。另外，我们的研究发现，HCC患者肠道菌群失调的发生率为81.9%。以往相关研究报道，HCC患者肠道细菌过度生长(肠道菌群失调的一种类型)的发生率为71.8%，明显高于肝硬化患者肠道菌群失调的发生率(41.1%)[17]。这是因为肠道内的胆汁酸可通过控制肠道环境的pH，抑制病原体的生长来维持肠道菌群的平衡[18]，但HCC患者由于胆汁酸的储存功能障碍，进入肠腔内的胆汁酸减少，肠道环境的pH升高，有利于病原体的定植生长，从而诱发肠道菌群失调。

HCC患者的手术创伤可明显影响肠道菌群的组成。陈燕凌等[2]研究表明，肝切除术后有益菌的数量减少，条件致病菌的数量增加，肠道菌群失调进一步加重。可能原因：肝切除术后易出现胃肠功能障碍，肠道蠕动受损，创造有利于条件致病菌繁殖的肠道内环境；有益菌如双歧杆菌数量的减少，对条件致病菌的拮抗作用减弱。另外，双歧杆菌产生的乳酸、乙酸等也相对减少，此时肠道pH升高，利于条件致病菌在肠道内的定植[19]。我们的研究也发现了类似现象，即术后双歧杆菌相对丰度的明显降低和肠杆菌相对丰度的显著升高，肠道菌群失调更严重。

本研究还发现，HCC手术急性应激后双歧杆菌的相对丰度与ALT水平呈负相关。肠道菌群失调的加重，其优势菌群在肠道内失去优势，对劣势菌群的拮抗作用降低，劣势菌群得以大量繁殖，产生过量的内毒素[7]，其主要活性成分LPS通过激活肝Kupffer细胞，释放过量细胞因子损害肝细胞[8,9]。相反，作为肝功能的敏感指标，ALT的升高提示肝功能损伤，肝功能损伤时窦周细胞如Kupffer细胞功能衰竭，可降低对内毒素的清除作用，大量LPS进入体循环[10]。当LPS与单核细胞表面的相应受体Toll样受体结合时，一系列的信号转导可诱导大量的炎症介质，导致全身炎症反应综合征(SIRS)的发生[20,21]。一方面，SIRS导致组织内高代谢状态，组织内氧需求量增加，肠上皮细胞的氧分压降低；另一方面，由于SIRS灌注量低，肾素—血管紧张素的激活引起小动脉收缩，而且肠道缺血又进一步加剧了小动脉的收缩[22]。此外，在动物模型中发现大量的炎症介质可以增加肠黏膜的通透性[23]。肠黏膜屏障因缺氧、缺血和肠黏膜通透性的增加遭到破坏，导致肠道菌群的改变。由此形成加重肝细胞损伤的恶性循环。高祀龙等[11]研究表明,酒精性肝病患者的双歧杆菌与TBiL、AST、ALT呈负相关。肠道菌群与肝功能之间的显著相关性亦被研究证明[24，25]。因此，肠道菌群的调节在促进HCC术后肝功能的恢复中有重要意义。

综上所述，HCC患者术前存在肠道菌群失调，表现为主要有益菌——双歧杆菌的减少和主要条件致病菌——肠杆菌的增加，HCC手术后的菌群失调进一步加重;术后双歧杆菌变化与肝功能有关。