姜硕　许哲祥　吴桐　郑春英

摘要 [目的]研究铁皮石斛组织培養苗活性成分变化规律，探讨其与组培苗生长的相关性。[方法]分别采用比色法和HPLC法对不同培养时间的铁皮石斛组织培养苗中多糖和黄酮含量进行测定。[结果]随着培养时间的增长，铁皮石斛组织培养苗中活性成分也不断增长，二者呈现出正相关性。[结论]采用活性成分含量测定方法可监测铁皮石斛组织培养苗的质量。

关键词 铁皮石斛;组织培养苗;多糖;黄酮;变化规律

中图分类号 R 931文献标识码 A文章编号 0517-6611（2020）23-0218-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.056

Study on the Variation of Active Compounds in the Tissue Culture Seedling of Dendrobium offcinale

JIANG Shuo1，2， XU Zhe-xiang1，2， WU Tong1，3 et al

（1. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology， Ministry of Education， Heilongjiang University， Harbin，Heilongjiang 150500;2. Key Laboratory of Microbiology， College of Heilongjiang Province， School of Life Sciences， Heilongjiang University， Harbin，Heilongjiang 150080;3. Key Laboratory of Molecular Biology，College of Heilongjiang Province，School of Life Sciences，Heilongjiang University，Harbin，Heilongjiang 150080）

Abstract [Objective]The variation of active compounds in the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale was studied in order to analyze the relation with the growth of the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale.[Method]Colorimetric method and HPLC method were used to determine the content of polysaccharides and flavones in tissue culture seedlings of Dendrobium officinale at different culture time.[Result]With the increase of the cultivation time， the active ingredients in the tissue culture seedlings of Dendrobium offcinale also increased， and the two showed a positive correlation. [Conclusion] The quality of the tissue culture seedling of Dendrobium offcinale can be evaluated by determination of the active compounds.

Key words Dendrobium offcinale;Tissue culture seedling;Polysaccharide;Flavone;Variation

铁皮石斛，兰科植物铁皮石斛（Dendrobium offcinale Kimura et Migo）的干燥茎[1]，药食两用名贵中药材，具有益胃生津、滋阴清热的功效[2]，含有多糖、黄酮、生物碱、氨基酸等多种活性成分[3]，具有抗肿瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]等活性作用。近年来，由于过度开采及各种环境因素的改变，使得铁皮石斛成为濒危药用植物，现被收录于《国家重点保护野生药材物种名录》[7]。

为了快速满足大众消费，植物组织培养技术以其快速生产繁育能力及工厂化生产能力，现已成为解决铁皮石斛资源短缺的最有效途径[8]。鉴于植物组织培养技术在铁皮石斛生产中的广泛应用，笔者以多糖和黄酮含量为指标，比较不同培养时期铁皮石斛组织培养苗中活性成分的动态积累情况，为高质量提高铁皮石斛组织培养的生产能力奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试材与试剂

1/2MS培养基[9]。

铁皮石斛原球茎，泉州正和堂生物科技有限公司惠赠;葡萄糖对照品（美国 Sigma 公司）;芦丁对照品（中国药品生物制品检定院）。甲醇为色谱纯级别，其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FL2200型高效液相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司）;752分光光度计（上海广谱仪器有限公司）。

1.3 铁皮石斛组织培养苗中多糖的动态变化

1.3.1 供试品溶液的制备。

分别取不同培养时间的铁皮石斛组织培养苗，烘干，精密称取0.5 g，加水溶解（料液比为1∶10），以50 ℃超声提取45 min，过滤，重复提取2次，合并滤液，以50 ℃减压浓缩至5 mL左右，加入95%乙醇溶液使醇浓度达到80%，放置过夜，弃去上清液，3 000 r/min离心5 min，将沉淀烘干。分别精密称取0.3 g，加水定容至1 mL，作为多糖供试品溶液，备用。

1.3.2 对照品溶液的制备。

精密称取葡萄糖对照品2.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀，即为对照品溶液（0.1 mg/mL），备用。

1.3.3 葡萄糖对照品标准曲线的绘制。

参照文献[10]，采用蒽酮-硫酸法，测定其在625 nm处的吸光度。以对照品溶液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程为y=0.571 4x+0.011 8（r=0.999 1），表明葡萄糖对照品在0.1～0.5 mg/mL线性关系较好。

1.3.4 铁皮石斛组织培养苗中多糖的动态变化。

参照文献[11]进行。

1.4 铁皮石斛组织培养苗中黄酮的动态变化

1.4.1 色谱条件。

色谱柱为Venusil XBP-C18柱;流动相为甲醇-水（50∶50）;流速为1 mL/min;检测波长为254 nm。

1.4.2 供試品溶液的制备。

分别取不同培养时间的铁皮石斛组织培养苗，烘干，精密称取0.2 g，加入95%乙醇（料液比1∶30），以50 ℃超声提取45 min，过滤，重复提取3次，合并滤液，在50 ℃条件下减压浓缩至干，残渣以1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液，备用。

1.4.3 对照品溶液的制备。

精密称取芦丁对照品0.2 mg，加入适量色谱甲醇溶解，制成0.2 mg/mL的芦丁对照品溶液，备用。

1.4.4 芦丁对照品线性关系考察。

取不同浓度的芦丁对照品溶液，各吸取 10 μL 注入HPLC中，以芦丁浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到线性方程为y=9 924 681x+22 764（r=0.999 8），最低检出质量浓度（以S/N≥3计）为0.6 μg/mL，表明芦丁在0.06～0.30 mg/mL具有良好的线性关系。

1.4.5 铁皮石斛组织培养苗中黄酮的动态变化。

将“1.4.2”中各供试品溶液注入HPLC，以“1.4.1”色谱条件进行分析测定。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛组织培养苗中多糖的动态变化

2.1.1 多糖测定方法学考察。

精密度试验、重复性试验、葡萄糖对照品在12 h内稳定性试验的RSD分别为0.95%、1.32%和1.97%;平均加样回收率为98.82%，RSD为3.01%。

2.1.2 铁皮石斛组织培养苗中多糖的动态变化。

对不同培养时间的铁皮石斛组织培养苗中多糖进行测定，结果见图1。从图1可以看出，在铁皮石斛组织培养苗的培养过程中，在7～28 d的培养阶段，多糖含量显著增长，表明铁皮石斛培养苗在此阶段处于生长旺盛期;在28～42 d的培养过程中，多糖含量处于缓慢增长的过程。由此说明，培养时间与多糖含量呈正相关，随着培养时间的增长，其多糖含量也呈现不断积累的过程，但达到一定的培养时间后，其多糖含量增长减慢并会随着组织培养苗的成熟而达到平稳的程度。

2.2 铁皮石斛组织培养苗中黄酮的动态变化

2.2.1 黄酮测定方法学考察。

精密度试验、重复性试验、芦丁对照品在24 h内稳定性试验的RSD分别为0.68%、0.82%和1.56%;平均加样回收率为99.06%，RSD为2.47%。

2.2.2 铁皮石斛组织培养苗中黄酮的动态变化。

对不同培养时间的铁皮石斛组织培养苗中芦丁进行测定，结果见图2～3。 从图2～3可以看出，在铁皮石斛组织培养苗的培养过程中，在7～21 d的培养阶段，芦丁含量处于增长的状态;在21～28 d的培养阶段，芦丁含量显著增长，表明铁皮石斛培养苗在此阶段处于生长旺盛期;在28～42 d的培养过程中，芦丁含量处于平稳增长的过程。由此说明，培养时间与芦丁含量也呈正相关，随着培养时间的增长，其芦丁含量也呈现不断积累的过程，但达到一定的培养时间后，其芦丁含量增长减慢并会随着组织培养苗的成熟而达到平稳的程度。

3 结论

该研究采用多糖和黄酮含量为指标监控铁皮石斛组织培养苗的生长发育动态，并通过上述2种成分的动态积累过程描述铁皮石斛组织培养苗的质量，结果表明，铁皮石斛组织培养苗的品质可以替代人工栽培，该结果可为解决铁皮石斛资源紧缺提供参考。

参考文献

[1] DING J T，TU H Y，ZANG Z L，et al.Precise control and prediction of the greenhouse growth environment of Dendrobium candidum[J].Computers and electronics in agriculture，2018，151：453-459.

[2] WANG M Y，SHEN C，AN M F，et al.Combined treatment with Dendrobium candidum and black tea extract promotes osteoprotective activity in ovariectomized estrogen deficient rats and osteoclast formation[J].Life sciences，2018，200：31-41.

[3] CUI H Y，MURTHY H N，MOH S H，et al.Protocorm culture of Dendrobium candidum in balloon type bubble bioreactors[J].Biochemical engineering journal，2014，88：26-29.