王艳　严敏鸣　黄忠荣　张磊萍　张强　林颖峥　熊炜　李树清

摘要 为建立牛血清中6种外源性病毒（BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV）的液相芯片检测方法，根据6种病毒的高度保守区域设计引物和探针，通过杂交偶联检测，利用Luminex检测仪检测荧光信号，建立了牛血清中6种外源性病毒的快速检测方法。结果表明，该试验建立的检测体系具有良好的特异性和敏感性，其检测灵敏度可达50拷贝/反应。该研究初步建立了同时检测牛血清中6种外源性病毒的液相芯片检测方法，为牛血清的质量把关提供了技术支持。

关键词 牛血清;外源性病毒;液相芯片

中图分类号 S 852.5文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）23-0116-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.028

Establishment of Liquichip Detection Method of Six Kinds of Exogenous Viruses in Bovine Serum

WANG Yan1，YAN Min-ming2，HUANG Zhong-rong3 et al

（1. Animal， Plant and Food Inspection and Quarantine Technology Center， Shanghai Customs， Shanghai 200135;2. Animal Disease Prevention and Control Center of Pudong New Area in Shanghai， Shanghai 200120; 3.Shanghai Customs， Shanghai 200135）

Abstract In order to establish the liquichip detection method of 6 kinds of exogenous viruses（BVDV，BPV，BTV，REOV，BPyV，RABV）in bovine serum，on the basis of the specific primers and their corresponding oligonucleotide probes of 6 kinds of viruses were designed， synthesized and modified. Specific probe labeled with biotin was prepared and coupled with fluorescence-coded microspheres. Luminex detector was used to detect fluorescence signal，a quick detection method of 6 kinds of exogenous viruses in  bovine serum was established. The results showed that this assay method displayed good specificity and sensitivity. The sensitivity test indicated the detection sensitivity could reach 50 copies. A liquichip detection method for  six kinds of exogenous viruses in bovine serum was preliminarily established，which provided the technology supports for the quality control of bovine serum.

Key words Bovine serum;Exogenous virus;Liquichip

隨着我国生物医药的发展，对血清的需求以每年25%的速度增长，对外依存度越来越高。牛血清在疫苗生产中被大量使用，其质量直接影响生物制品的质量安全，特别是病毒类生物活性物质污染会严重影响制品的质量安全。日本东京大学的Harasawa等[1]报道，在5批人用麻风腮及风疹疫苗成品中检出了牛病毒性腹泻病毒（BVDV）RNA。Brown等[2]报道，由于使用了污染BVDV的胎牛血清，导致了胎牛肾细胞、牛肾细胞、牛鼻甲骨细胞、猪肾细胞、猫肾细胞核Vero细胞等多种细胞系的污染[3]。

牛腹泻病毒是疫苗生产中常见的污染物及严重的外源性致病原之一，因此牛血清中BVDV的检测尤为重要[4]。牛细小病毒（bovine parvovius， BPV）、蓝舌病毒（bluetongue virus， BTV）、呼肠孤病毒（reoviridae， REOV）、牛多瘤病毒（bovine ploymavirus， BPyV）、狂犬病病毒（rabies virus， RABV）也是牛血清中重要的病原外源因子，牛血清的质量应严格要求[5-7]，由于牛血清质量的把关是生物制品质量的重要环节，原上海检验检疫局曾在进口胎牛血清中检测出牛病毒性腹泻病毒[8]，因此建立外源性病毒的快速检测方法将有助于把控牛血清质量，防止外源性病毒的污染。笔者以牛血清中BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6种重要外源性病毒为研究对象，建立可以同时检测的液相芯片检测方法，并对其灵敏度、特异性等指标进行验证。

1 材料与方法

1.1 试验材料

藻红蛋白标记的链霉素-亲和素（SA-PE）采购自Invitrogen公司;6种不同编号的荧光编码微球购自Bio-Rad公司;Luminex200为Luminex公司产品;BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV质粒由上海海关动物检疫实验室保存，浓度为 500拷贝/μL，保存于-20 ℃下备用。

1.2 试验方法

1.2.1 探针及引物的设计和合成。根据GenBank数据库发布的基因序列，应用Primer 5.0序列分析软件进行序列分析、引物、探针设计，并分别在5′端和3′端进行修饰（表1）。引物、探针送至上海生物工程有限股份公司合成。

1.2.2 单对引物及多重引物的扩增产物电泳检测。利用设计的引物对目标质粒进行单重和多重扩增，以鉴定引物的特异性。PCR反应体系：10×buffer（Mg2+） 2.5 μL、dNTP （2.5 mol/L）1.0 μL、引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、Taq 0.5 U、ddH2O 18.5 μL，总PCR体系25 μL。多重PCR引物的加入量REOVF/R 1.5 pmol，BPVF/R 2.0 pmol，BTVF/R 3.0 pmol，BVDVF/R 2.0 pmol，BPyVF/R 1.5 pmol，RABVF/R 2.0 pmol。PCR扩增程序如下：95  ℃预变性 10 min;95  ℃ 30 s，52  ℃ 30 s，72  ℃ 20 s，35个循环;72 ℃再延伸1 min。反應结束后，取5 μL PCR产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。

1.2.3 微球探针的交联。在EP管中加入相应的荧光编码微球100 μL（表2），5 000 r/min离心10 min 后弃上清，并用ddH2O冲洗2次;用100 μL 0.1 mol/L pH 6.0的MES将之悬浮后，加入0.2 nmol/μL探针3 μL，充分混匀后，加入15% EDC，用铝箔纸包裹EP 管于37 ℃条件下放置30 min;离心吸去上清，用0.1% SDS洗涤2次后，用50 μL TE缓冲液（pH 8.0）重新悬浮后，4  ℃下避光保存，备用[9-10]。

1.2.4 杂交捕获检测。取PCR产物5 μL，加入微球溶液25 μL（荧光编码微球的数量约80个/μL），充分混合均匀后按照以下步骤进行杂交反应：94  ℃变性3  min，50 ℃孵育30  min;随后加入0.2 μg/μL SA-PE 70 μL，50 ℃孵育20  min，孵育结束后直接上机读取信号（试验须在微球个数不小于20个且背景空白荧光强度不高于300的情况下才成立）。

1.2.5 探针特异性的检测。每个反应体系25 μL，将6种不同编码的荧光微球混合，与每一对引物PCR扩增产物进行杂交。

1.2.6 液相芯片检测体系的建立。取20份其他检测方法检测为阴性的样品进行检测，计算每种微球平均荧光强度（median fluorescent intensity，MFI）的平均值和标准差，以平均值+3倍标准差所得的值作为对应检测指标的cut-off值，确定阈值，高于cut-off值就视为阳性。

1.2.7 液相芯片检测体系特异性。将牛腹泻病毒、牛细小病毒、蓝舌病毒、呼肠孤病毒、牛多瘤病毒、狂犬病毒、牛副流感病毒3型（bovine parainfluenzavirus 3，BPIV3）、传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、赤羽病病毒（Akabane disease virus， ADV）的DNA作为PCR扩增模板，利用已建立的检测方法进行杂交检测。

1.2.8 液相芯片检测体系灵敏度。将质粒BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV进行5、10、50倍稀释，并分别作为PCR扩增模板，利用已建立的检测方法进行杂交检测。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增产物的电泳检测结果 扩增结果表明，该试验设计的引物具有良好的特异性（图1）。

2.2 探针特异性检测 6种混合微球对单一引物扩增产物的杂交检测结果如表3所示。

以上数据显示，混合的6种探针能特异性识别捕获引物，表明该试验设计的探针具有良好的特异性。

2.3 液相芯片检测体系的建立

20份阴性样品经PCR扩增的产物用于液相芯片检测方法阈值的确定，计算MFI的平均值和标准差，阈值=42.15+3×10.62=74.01。

2.4 液相芯片检测体系特异性

特异性检测结果表明，建立的液相芯片体系对REOV、BPV、BTV、BVDV、BPyV、RABV产生特异性反应;与牛血清其他重要病原不产生反应，表明建立的液相芯片检测体系具有良好的特异性（表4）。

2.5 液相芯片检测体系灵敏度 灵敏度试验结果见表5，所建立的检测体系的灵敏度为50拷贝/反应。

3 讨论

动物疫苗的主要作用是预防传染病。动物疾病传入某一国家，其最主要的风险途径是通过进口活动物及动物产品，通过疫苗进口传入疾病则较为少见。但是，由于动物疫苗本身产品的特殊性，在疫苗生产期间若使用的种子毒株、细胞培养物、动物或动物源性成分被污染，或发生交叉污染，或疫苗本身灭活工作没有做好，动物疫苗在生产过程中就会被污染。此类污染疫苗一经使用，就会将病原直接传入动物体内。为此，对进口动物疫苗进行病毒安全性研究，为控制其风险提供有力保障。该研究利用液相芯片技术，建立了能特异性检测BVDV、BPV、BTV、REOV、BPyV、RABV 6种病原的液相芯片检测方法。该检测方法能够对目标基因进行快速检测，其检测灵敏度达50拷贝/反应，特异性好。

参考文献

[1]HARASAWA R，TOMIYAMA T.Evidence of pestivirus RNA in human virus vaccines[J].Journal of clinical microbiology，1994，32（6）：1604-1605.

[2] BROWN F，CARTWRIGHT T，HORAUD F，et al. Animal sera， animal sera derivatives and substitutes used in the manufacture of pharmaceutical： viral safety and regulatory aspects[J]. Dev Biol Stand， 1999，99：45-47.

[3] 马岩松. 新生牛血清病毒检测[D].长春：吉林农业大学，2011：3-4.

[4] 陈波，徐程林，董小曼，等. 牛血清中牛腹泻病毒牛肾细胞直接病变检测方法的建立[J].中国生物制品学杂志，2009，22（8）：819-822.

[5] 刘文静. 保证牛血清质量促进生物制品品质的提高[J]. 科技情报开发与经济，2011，11（5）：58-59.

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[7] 金亦宏，马欣，周莉薇. 国产牛血清的现状[J]. 中国生物制品学杂志，2004，17（4）：254-256.

[8] 张强，李树清，李健，等. 进口胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒污染的检测[J].中国动物检疫，2013，30（2）：55-57.

[9] 王艳，沈家红，蒋蔚，等.6种人兽共患病病原核酸液相芯片检测体系的建立[J].中国动物检疫，2018，35（12）：80-84.

[10] 王政，蒋静，张磊萍，等. 虾桃拉病毒、黄头病毒和白斑病毒液相芯片快速检测方法的建立[J]. 中国动物传染病学报，2017，25（2）：77-81.

基金项目 上海市科学技术委员会科研项目（16DZ0501502）。

作者简介 王艳（1981—），女，江苏南通人，高级兽医师，博士，从事动物检疫工作。

收稿日期 2020-04-15;修回日期 2020-05-12