刘焕兴，蔡仲卿，沈新升，陈作喜

（温州市中西医结合医院 骨伤科，浙江 温州 325000）

随意皮瓣没有轴心血管的限制，取皮的位置及方向较其他类型皮瓣更加灵活，因此被广泛应用于整形、创伤、手显微外科等多种临床手术的组织修复重建[1-2]。也由于随意皮瓣内没有知名血管走行，其血运主要依靠蒂部的微血管网供血，所以随意皮瓣血运较差，容易发生皮瓣缺血性坏死。特别是当皮瓣长宽比超过2:1时，皮瓣远端极易发生坏死。这极大影响了随意皮瓣的临床应用及其临床疗效。因此，寻找可以促进随意皮瓣存活、增加皮瓣血运、减少皮瓣坏死面积的方法具有重要临床意义。现有研究表明，中医活血化瘀的方法有促进微循环、改善血运的作用[3]。中医行气活血的方剂中，血府逐瘀汤应用较广，且有研究表明其具有保护血管内皮细胞的功效[4-5]。但是血府逐瘀汤能够促进随意皮瓣存活尚未可知，本研究分析了该方对大鼠随意皮瓣存活的作用及其相关机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：健康成年雄性SD大鼠72只，体质量200～250 g，由上海斯莱克动物公司提供，动物许可证号：SCXK（沪）2007-0005，合格证号：2007-000548429。所有动物在温度为（24±0.5）℃，湿度为45%～50%，通风良好的环境下饲养。为减少实验误差，动物实验均由同一名医师操作。

1.1.2 药物与试剂：血府逐瘀汤：当归9 g，生地9 g，桃仁12 g，红花9 g，枳壳6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗6 g，川穹6 g，牛膝9 g，由温州市中西医结合医院中药房提供。将药材用蒸馏水浸泡1 h，水煎2次后过滤取液，煎液加热浓缩至含生药量1.3 g/mL，熬制完毕，放入蒸汽灭菌锅中灭菌，后置于4℃冰箱保存。抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体购自美国Proteintech公司，兔二抗购自北京中杉金桥公司，BCA试剂盒购自美国Thermo Fisher科技公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备及分组：采用改良的McFarlane模型[6-7]建立大鼠随意皮瓣：4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠俯卧位固定，剃除背部毛发，消毒铺巾，以大鼠两髂嵴连线作为皮瓣蒂部，向头端方向在背部正中建立随意皮瓣（9 cm×3 cm），切开皮肤及皮下组织，达深筋膜，分离皮下组织，掀起皮瓣，结扎知名血管后，以医用慕丝缝线间断缝合，创口周围消毒，为减少实验误差，动物实验均由同一名医师操作。将建立模型的大鼠按随机数表法分为4组，每组18只，根据既往文献报道选择用药浓度，相应用药方案如下[8]：①对照组：0.9%氯化钠溶液10 mL·kg-1·d-1灌胃；②血府逐瘀汤高剂量组（高剂量组）：生药13 g·kg-1·d-1灌胃；③血府逐瘀汤中剂量组（中剂量组）：生药6.5 g·kg-1·d-1灌胃；④血府逐瘀汤低剂量组（低剂量组）：生药3.25 g·kg-1·d-1灌胃。

1.2.2 标本采集：大鼠造模术后连续给药7 d，每天于8：00及17：00给药。7 d后以10%戊巴比妥钠过量腹腔注射处死大鼠，沿皮瓣中轴线将皮瓣三等分：蒂部（I区），中部（II区），头部（III区），切取II区中心位置的组织标本（0.5 cm×0.5 cm）。

1.2.3 皮瓣存活面积比测量：术后1～7 d，每日观察皮瓣存活情况并记录。皮瓣颜色发黑、干硬、无毛发生长，考虑为皮瓣坏死；皮瓣颜色红润、柔软、新鲜毛发生长，考虑皮瓣存活。第7天，大鼠在麻醉状态下，沿皮瓣中轴线测量存活皮瓣存活面积并记录。采用照片软件扫描法测量皮瓣存活面积，拍摄第7天大鼠处死前的皮瓣照片，通过电脑扫描后，用Image J软件勾勒皮瓣存活面积并计算。皮瓣存活面积比=（存活的皮瓣面积/总皮瓣面积）×100%。

1.2.4 组织学检测：皮瓣术后第7天，取II区皮瓣标本浸泡于4%多聚甲醛中固定1 d，石蜡包埋，制成厚度为4 μm的切片，HE染色。200倍光学显微镜下观察皮瓣的肉芽组织生长、皮瓣水肿、炎性浸润、血管新生等情况。每个组织随机挑选6个视野计数微血管横断面数目，计算平均数并换算为单位面积（/mm2）下的皮瓣微血管数，即微血管密度（microvessel density，MVD）。

1.2.5 Western blot法检测：术后7 d，取II区皮瓣标本，研磨匀浆，用BCA试剂检测蛋白浓度并配平，进行Western blot法检测四组标本内的VEGF表达量（抗大鼠VEGF浓度1:1 000，兔二抗1:10 000）。条带用Image Lab 3.0软件定量检测。

1.2.6 SOD、MDA表达的检测：术后7 d，取皮瓣II区标本，称取等量标本，在冰水浴中制成体积分数为10%的组织匀浆液，3 500 r/min离心15 min后取上清液，按照SOD、MDA检测试剂盒说明书，检测各组标本中的SOD、MDA含量。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS19.0软件进行统及低剂量组（P=0.019），差异有统计学意义，见图1。计学分析。所有数据采用±s表示，对照组和各剂量组间的皮瓣存活面积、血管密度、VEGF表达量、SOD及MDA含量采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同剂量组血府逐瘀汤对大鼠皮瓣存活面积比的影响 皮瓣术后第1天起，4组大鼠的皮瓣都出现不同程度的水肿，远端呈现暗红色，但未出现明显坏死。随后数天内，各组远端皮肤开始出现不同程度坏死，皮肤逐渐发黑、干硬、皱缩，甚至出现结痂，坏死组织逐渐向皮瓣蒂部发展，而各组的蒂部皮瓣皮肤皮肤红润、柔软。术后第7天，坏死与存活的皮瓣组织之间的界限逐渐稳定。血府逐瘀汤低剂量组（P=0.004）、中剂量组（P＜0.001）、高剂量组（P=0.007）的皮瓣存活面积比明显高于对照组，其中中剂量组的存活面积比优于高剂量组（P=0.043）

图1 各组大鼠皮瓣存活面积比

2.2 不同剂量组血府逐瘀汤对大鼠皮瓣微血管生长的影响 术后第7天，大鼠II区皮瓣出现炎性浸润、组织水肿、血管新生，见图2。其中，相较于对照组的MVD值，低剂量组、中剂量组、高剂量组明显有更多的微血管生长，差异有统计学意义（P＜0.001）。不同剂量组间的比较：中剂量组的MVD较低剂量组、高剂量组更高，差异有统计学意义（P=0.003），余二组间差异无统计学意义（P=0.326），见图3。

图2 各组大鼠皮瓣皮下组织的HE染色结果（×200）

图3 各组大鼠皮瓣皮下组织的MVD

2.3 不同剂量组血府逐瘀汤对皮瓣组织VEGF表达的影响 Western blot检测显示：与对照组相比，血府逐瘀汤低剂量组（P=0.048）、中剂量组（P＜0.001）、高剂量组（P＜0.001）的VEGF表达量均存在显著差异。中剂量组VEGF表达量显著高于低剂量组（P=0.004）、高剂量组（P=0.048），高剂量组与低剂量组间差异也有统计学意义（P=0.029），见图4。

2.4 不同剂量组血府逐瘀汤对皮瓣组织SOD、MDA表达的影响 与对照组比，低剂量组（P=0.017）、中剂量组（P=0.026）、高剂量组（P=0.004）的SOD表达量明显增加，差异有统计学意义，而不同剂量组之间的SOD表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组MDA表达量相比，低剂量组（P=0.026）、中剂量组（P=0.003）、高剂量组（P=0.004）的表达量显著降低，差异有统计学意义，而不同剂量组之间的MDA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图4 各组大鼠皮瓣的VEGF相对光密度值

表1 各组大鼠皮瓣组织的SOD及MDA含量（每组n=6）

3 讨论

随意皮瓣远端容易发生缺血性坏死，目前认为主要与随意皮瓣血供不足有关[1-2，9]。皮瓣主要依赖于皮瓣蒂部的微血管网供血，待蒂部微血管网的新生血管向皮瓣远端生长，远端皮瓣的缺血组织内微循环重建后，皮瓣才能依赖其血供存活[10-11]。因此，血管新生对随意皮瓣存活具有重要意义。同时，皮瓣组织缺血后血流再通，会引起缺血再灌注损伤，这对皮瓣存活也有重要影响。

血府逐瘀汤具有活血袪瘀、行气止痛的功效，在中医行气活血法中应用较广。当前文献已表明，血府逐瘀汤能改善微循环，促进血液循环[12]，细胞实验显示了血府逐瘀汤可以保护血管内皮细胞，促进VEGF表达[13]。因此我们将血府逐瘀汤应用于随意皮瓣大鼠模型，检测其疗效及相关机制。

本研究结果中，血府逐瘀汤不同剂量组的大鼠皮瓣大体存活面积均较对照组明显改善，而不同剂量组内的比较表明中剂量组的治疗效果最佳。通过组织学实验发现，各药物治疗组的组织内的微血管数量明显多于对照组，而中剂量的微血管数量在各剂量组中最多，提示血府逐瘀汤确实可以促进大鼠随意皮瓣的存活，其治疗效果可能是通过促进缺血组织内的微血管生长，改善微循环实现的，而中剂量组的治疗效果相较而言是其中最佳的。高剂量组的治疗效果反而不如中剂量组，我们猜测可能的原因，一是该药剂有活血化瘀的功效，剂量过高可能会引起凝血功能异常，影响皮瓣愈合，出血血肿也会影响新生血管的发生；二是过高剂量的中药可能会引起肝肾功能损害。另外，根据文献，血府逐瘀汤用于人体的常规剂量与中剂量组相近，高剂量组剂量加倍，可能剂量过高引起了不良反应[14]。

新生血管生成与缺血组织内微循环的重建密切相关，因此，血管新生对改善组织缺血、促进皮瓣存活至关重要。血管新生主要分为以下步骤：原细胞连接破坏，血管内皮细胞分化增值，出芽，新生血管成熟[15]。研究表明，VEFG是血管新生的关键因子，其直接作用于血管内皮细胞，促进其有丝分裂及增殖分化[16]，从而促进皮瓣内的血管新生，增加缺血组织内的微血管数量，加快皮瓣远端与蒂部及皮瓣与切缘之间的血运重建，从而改善微循环，加快血运重建。本研究表明，在皮瓣坏死区与存活区交界的II区，血府逐瘀汤治疗组的MVD均增加，同时VEGF的阳性表达也增加，血府逐瘀汤可能是通过增加VEGF的表达来促进皮瓣缺血组织的血管新生，从而改善皮瓣血运的。其中，中剂量组相较高剂量组、低剂量组VEGF的表达量最高，同时局部MVD最大，提示中剂量组对通过VEGF促进血管新生的疗效最好。

当缺血组织内的微循环重建、血运再通后，组织内会发生缺血再灌注损伤，这是组织缺血后损伤坏死的重要因素[17]。缺血再灌注损伤中，氧自由基大量产生，与细胞膜发生脂质过氧化反应，从而破坏细胞。该过程中，MDA会作为脂质过氧化反应的代谢产物生成，因此其含量可以间接反映组织的缺血再灌注损伤程度[18]。SOD可通过歧化反应清除超氧阴离子自由基，其中内源性抗氧化应激的保护作用[19]。本研究证实，血府逐瘀汤可促进内源性SOD的活性或增加其表达量，并减少了MDA的表达，表明该方剂可促进氧自由基清除、抑制脂质过氧化反应，从而减少皮瓣的缺血再灌注损伤。

综上所述，本研究表明血府逐瘀汤可促进大鼠随意皮瓣的存活，其中，中剂量组治疗效果最佳。其机制可能是通过促进缺血组织内的VEGF表达，从而增加组织内的新生血管密度，促进微循环重建，同时抑制组织的缺血再灌注损伤。