黄科峰，江明君，王华英，戚赛春

（宁波大学附属人民医院 心胸外科，浙江 宁波 315040）

肺癌是世界范围内最常见的肿瘤，也是致死率最高的肿瘤之一，分为小细胞肺癌（13%）和非小细胞肺癌（87%，non-small cell lung cancer，NSCLC），5年总生存率仅18.2%[1]。目前临床上主要治疗方法为手术、化疗、放疗等，但肺癌发展到晚期后治疗效果往往较差[2]。白血病抑制因子（leukemia inhibitor factor，LIF）是IL-6家族成员之一，在人类生殖、骨重塑、下丘脑-垂体-肾上腺轴、神经肌肉系统、心脏、造血系统、肿瘤等方面都有重要作用。LIF已在许多实体瘤中发现有表达，包括乳腺癌、皮肤癌、结直肠癌、鼻咽癌和肺癌，且LIF在体外刺激多种肿瘤的生长，抑制肿瘤细胞分化并诱导其转移，但其作用特点及机制有待进一步明确[3-4]。本研究通过评价NSCLC患者手术切除标本和LIF干预肺腺癌A549细胞系，探讨LIF在NSCLC病理过程中作用机制及特点。

1 材料和方法

1.1 材料 癌组织及癌旁组织均取自本院患者手术切除标本。CCK-8试剂盒、LIF抗体、磷酸化JAK1抗体、JAK1抗体、磷酸化STAT3抗体（美国Santa Cruz公司），GAPDH（美国CST公司），二抗（上海碧云天生物科技有限公司）；AB629细胞（中国科学院上海细胞库）；胎牛血清、DMEM培养基（美国Hyclone公司）；反转录试剂盒、PCR试剂盒（美国Bio-Rad公司）；重组LIF（美国Chemicon公司）；Transwell小室套装（美国Corning公司）。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法观察LIF蛋白表达：患者肺癌组织和癌旁组织脱水、石蜡包埋后切片，脱蜡后用蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min后进行抗原修复，用3%过氧化氢室温孵育5～10 min后，PBS冲洗3遍，每次 2 min。10%山羊血清封闭后，室温孵育10 min后倾去血清，滴加对应的一抗，37℃孵育2 h后4℃过夜。第2天PBS冲洗3遍，每次2 min，滴加对应的二抗，37℃孵育2 h，PBS冲洗3遍，每次2 min。用显色剂显色，PBS冲洗，复染，梯度乙醇脱水后用二甲苯透明，中性树胶封片。常规显微镜下随机10个视野条件下，记录棕色阳性细胞数。

1.2.2 RT-qPCR检测LIF mRNA表达：取NSCLC患者手术切除的癌组织和癌旁组织匀浆，加入1 mL细胞裂解液，提取组织总RNA。使用RNA反转录试剂盒将RNA转录成为cDNA。反应条件为：37℃，15 min；98℃，5 min。FQ-PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq TMI II Mix 10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，dd H2O 8 μL，总体积为20 μL。反应条件：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 15 s；72℃ 20 s；扩增40个循环。扩增结束后，采用ΔΔCT分析结果。引物序列LIF-F：CCTCTTCCCATCACCCCTGTAAGAAGG，LIF-R：CCTGGACCACCACACT；GAPDH-F：TCATCACTATTG GCAACGAGC，GAPDH-R：AACAGTCCGCCTAGAAGCAC。

1.2.3 CCK-8检测细胞增殖：取生长状态良好的A549细胞制备成1×105/mL的细胞悬液，每孔100 μL 加入96孔细胞培养板中置于培养箱内37℃、5% CO2条件预孵育24 h后，各孔随机分为以下4组：A549细胞对照组（LIF空白溶剂），LIF干预A549细胞组（50、100、150 ng/mL LIF）每组设5个副孔。继续孵育12 h后向每孔加入10 μL CCK-8工作液，继续在培养箱中孵育2 h。采用双波长测定吸光度，检测波长450 nm，参比波长600 nm，读取各孔OD值，以OD值间接反映细胞增殖状况。同法培养细胞至加入CCK-8工作液前，弃去培养基，PBS洗涤后用裂解液裂解各孔细胞，BCA法蛋白定量后加入Loading Buffer，100℃煮10 min蛋白变性，样本-80℃保存待用。

1.2.4 Transwell小室法检测细胞侵袭：Transwell小室均匀涂布基底膜基质（1 mg/mL）后于37℃孵育0.5 h，分别吸取1×105个细胞接种至上室，并将各小室分为以下4组：A549细胞对照组（LIF空白溶剂），LIF干预A549细胞组（50、100、150 ng/mL LIF），每组设3个副孔；各小室下室加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。上述小室内盖住后置于培养箱内37℃、5% CO2条件培养48 h后，将滤膜用多聚甲醛固定后拭去表面细胞，Giemsa染色后随机选择10个不同视野记录细胞数。

1.2.5 Western blot检测LIF蛋白表达：配制10%聚丙烯酰胺凝胶，固定于电泳槽后，以30 μg/孔注于泳道中开启电泳，湿法转模结束后用5%牛奶封闭1 h，用对应的一抗4℃孵育过夜，洗膜后加入对应的二抗，常温孵育1 h后，洗膜。条带浸淋增强化学发光试剂后用化学发光显影仪显影。结果以各泳道GAPDH灰度值作为参考，目的条带与其灰度值的相对值进行组间比较。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS12.0软件进行分析。计量资料以±s表示，2组间比较采用t检验，多组间差异采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 NSCLC患者癌旁组织（A）和癌组织（B）LIF阳性表达（棕色颗粒为LIF阳性表达细胞）（×400）

2.1 LIF在人NSCLC癌变组织中的表达 图1免疫组化结果显示，NSCLC患者的肺癌组织中LIF阳性表达率明显偏高，且分布较为广泛，提示较大范围和高水平的LIF组织表达。PCR结果显示NSCLC癌组织中LIF mRNA的表达明显高于非病变组织，Western blot结果显示NSCLC患者癌组织的LIF蛋白表达水平明显增高，见图2。

图2 LIF mRNA（A）和蛋白（B）在NSCLC患者癌组织和癌旁组织中的表达

2.2 重组LIF对A549细胞增殖的影响 结果显示100、150 ng/mL LIF处理48 h可促使A549细胞活力明显增强（P＜0.05），见图3。

图3 LIF孵育48 h促进A549细胞增殖

2.3 重组LIF对A549细胞侵袭的影响 A549细胞经重组LIF处理48 h后，A549细胞通过其自身迁移能力通过基底膜的细胞数目越多提示细胞侵袭能力越强。经100、150 ng/mL LIF处理后的A549细胞通过基底膜的细胞数显著多于未经LIF处理的细胞（P＜0.05），见图4。

图4 LIF孵育48 h促进A549细胞迁移

2.4 LIF对A549细胞JAK1/STAT3通路的影响 A549细胞经重组LIF处理后，细胞中JAK1磷酸化水平显著提高，其下游重要的分子STAT3磷酸化水平也明显提高（P＜0.05），见图5。

3 讨论

LIF最初被克隆出来时被视为髓样白血病细胞系（M1）的分化诱导物和增殖抑制剂[5]。作为IL-6家族成员，与其他IL-6家族细胞因子类似，LIF以紧凑的四螺旋束形式存在，其分子构型极为稳定，为其发挥生理作用创造了有利条件。LIF和其受体已在许多实体瘤中发现有表达，包括乳腺癌、皮肤结直肠癌和鼻咽癌[6]。体外实验已经证明了这些癌细胞上高LIF水平与肿瘤复发和放射抵抗以及LIF诱导的放射抵抗和DNA修复抑制有关[7]，然而其在NSCLC患者组织上的表达研究较少。

本研究发现，LIF在NSCLC细胞A549中持续较高水平表达，活化水平亦高。LIF可通过促进NSCLC相关癌细胞的增殖、侵袭作用促进癌细胞活化，可能的作用机制是通过活化JAK1/STAT3信号通路。

JAK/STAT信号通路与肺癌关系密切，尤其是JAK/STAT1、JAK/STAT3、JAK/STAT5是该信号通路几条参与肺癌作用的经典通路，其中JAK1/STAT3信号通路在肺癌中研究较多[8-9]。在一项对NSCLC的研究中发现，列入研究的10例NSCLC患者全部出现STAT3的高度磷酸化[10-11]，另外扩大样本检测发现，约有55%的NSCLC患者及大多数NSCLC相关细胞系都发现了STAT3的异常活化。说明STAT3A的高度活化与NSCLC密切相关[12]。

细胞膜上相关受体一旦被LIF激活，受体结合的JAK1最初将LIF受体胞内域上的酪氨酸靶向磷酸化。磷酸化的受体链（gp130和LIF-Rβ）充当支架以募集许多信号转导实体，其中最重要的可能是STAT3。STAT蛋白是转录因子家族，通常以非活性状态存在于细胞质中[13]。STAT3一旦募集到相关效应分子，其自身就会被JAK1磷酸化，这一激活步骤使其形成具有信号功能的二聚体[14]，该二聚体易位进入细胞核并上调适当的细胞因子反应性基因的转录。本研究发现LIF促进A549细胞的过度活化是通过JAK/STAT信号通路中JAK1/STAT3所实现的，但具体机制尚不明确。下一步将进一步明确LIF作用JAK1/STAT3信号后的相互作用及信号间的联系特征。

图5 Western blot检测A549细胞经不同浓度LIF干预后JAK1和STAT3表达情况

综上，NSCLC患者肿瘤组织存在LIF过表达现象，过表达的LIF可通过JAK1/STAT3信号促进肺癌细胞的增殖和迁移（侵袭），从而促进该病病程的发展。LIF可能作为一个重要靶点干预NSCLC的疾病进程。