刘 洋，周晶辉，赵 强，赵士敏，许 岗

(湖南福来格生物技术有限公司，湖南 长沙 422010)

丙酮酸是生物代谢的重要中间体，丙酮酸及其盐被越来越广泛地应用于药物前体、食品添加剂和减肥补充剂等的制备，市场潜力巨大[1-2]。乳酸是制备丙酮酸的重要原料，其价格仅是丙酮酸的10%。随着生物技术的发展，生物催化越来越多地运用于丙酮酸的制备[3]。以乳酸为原料生物催化制备丙酮酸的常用酶有乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、乳酸氧化酶(lactate oxidase，LOx)[4-5]。其中LDH需要有NAD+参与反应，其价格昂贵，不易于工业化生产[5]；而LOx作为一种黄素蛋白酶，以黄素核苷酸(FMN)作为辅因子，FMN和酶蛋白牢固结合，反应过程中无需额外添加辅因子，节约了生产成本[6-7]。因此，以LOx为催化用酶更适合于丙酮酸的工业化生产。

固定化酶在生产中具有产物易分离、可重复使用等优点，相对于游离酶更具应用价值[8-9]。目前，文献报道的固定化LOx多用于制备检测微量乳酸的生物传感器[10-12]，且不具备生产能力；而用于工业化生产丙酮酸的固定化LOx也未能克服固定化酶稳定性差的问题，如刘真等[13]制备的磁性壳聚糖固定化LOx转化5批次后，残余酶活仅70%；王艳等[14]采用包埋法制备的海藻酸钙凝胶包埋LOx反应5批次后，残余酶活仅85%。酶的基本性质对酶固定化有直接影响。鉴于此，作者首先对LOx游离酶的基本性质进行研究，优化LOx的固定化条件，并考察固定化LOx的使用稳定性及储存稳定性，以期为固定化LOx的工业化应用提供参考。

1 实验

1.1 菌种与试剂

乳酸氧化酶重组菌Pet-30-avLOx，自行克隆、构建并保存。

ECHA/S氨基载体，意大利Resindion S.R.L公司；ES-1环氧树脂，天津南开和成科技有限公司；乳酸(含量80%)，河南金丹乳酸科技股份有限公司；过氧化氢酶(0.3 MU·mL-1)，山东泰安信得利生物工程有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 LOx的分离纯化

1.2.1 发酵液的制备

挑取保存的E.coliBL21(DE3)/Pet-30-avLOx单菌落接种到含有50 mg·L-1卡那霉素的LB培养基中，37 ℃、220 r·min-1摇床过夜培养；将培养液按1.5%的接种量转接到含有50 mg·L-1卡那霉素的160 mL TB培养基中，37 ℃、220 r·min-1培养至OD600值约为0.4～0.6，加入1 mmol·L-1IPTG，25 ℃、220 r·min-1过夜诱导表达，即得发酵液。

1.2.2 LOx的分离纯化

将上述发酵液于4 ℃、5 000 r·min-1离心3 min，收集菌体；用pH值7.5的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液重悬菌体；控制均质机压力800～900 bar，均质3次破碎菌体后，于4 ℃、10 000 r·min-1离心15 min，收集上清液；上清液用NI柱纯化，10 mmol·L-1咪唑洗涤至无蛋白流后，再用300 mmol·L-1咪唑洗脱；用10 kD超滤膜浓缩脱盐，即得LOx游离酶。

1.3 LOx的固定化

1.3.1 固定化载体的预处理

氨基载体活化：将100 g ECHA/S氨基载体用pH值8.0的100 mmol·L-1磷酸盐缓冲液清洗，真空抽干溶液后，加入400 mL终浓度为5%的戊二醛溶液，维持pH值为7.8～8.2，25 ℃搅拌1 h后真空过滤，再用20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液清洗至无戊二醛残留。

环氧基载体清洗：用20 mmol·L-1磷酸盐缓冲液清洗ES-1环氧树脂至无泡沫产生。

1.3.2 固定化LOx的制备

向LOx游离酶液中加入一定浓度的磷酸氢二钾溶液，用磷酸氢二钾溶液调节pH值，按一定投料比(游离酶与载体的比例，U∶g，下同)加入ES-1或ECHA/S载体，搅拌过夜，用pH值7.5的25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液洗涤5次，即得ES-1固定化LOx、ECHA/S固定化LOx。

1.4 固定化LOx酶活的测定

用0.1 mol·L-1pH值7.5的Tris-HCl缓冲液配制5%乳酸溶液。将40 mL经30 ℃预热的5%乳酸溶液加入到30 ℃恒温水浴杯中，加入适量固定化LOx、0.5 mL过氧化氢酶(酶活>20 000 U·mL-1)，0.7 L·min-1通氧反应10 min后，取上清液1 mL置于50 mL容量瓶中，采用高效液相色谱测定丙酮酸的生成量。

色谱条件：色谱柱为CenturySIL C18-BDS(4.6 mm×200 mm, 5 μm)，流动相为0.58%磷酸二氢铵(pH值3.5)-甲醇(100∶5，体积比)，流速1.0 mL·min-1，检测波长215 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

酶活定义：在30 ℃、pH值7.5的条件下，每分钟生成1 μmol丙酮酸所需的酶量即为1个酶活单位(U)。比酶活为1 mg酶所具有的酶活单位。

1.5 固定化LOx的使用稳定性及储存稳定性

在350 mL反应体系中加入6%乳酸、6 300 U固定化LOx、5 mL过氧化氢酶、30 μL消泡剂。控制通氧量为240 L·h-1、反应温度为30 ℃、pH值为6.8～7.0。每0.5 h取样，测定丙酮酸生成量和乳酸残留量。当乳酸残留量小于3 mg·mL-1时，即认为达到反应终点。用去离子水将固定化LOx清洗干净后，进行下一批次反应，考察固定化LOx的使用稳定性。

分别将1.5 g固定化LOx加入到若干支10 mL灭菌离心管中，于4 ℃储存，持续监测固定化LOx的储存稳定性。

2 结果与讨论

2.1 LOx游离酶的基本性质

2.1.1 pH值稳定性

LOx游离酶酶活为688.4 U·mL-1，比酶活为158.5 U·mg-1。不同pH值下，将LOx游离酶于4 ℃储存45 d，考察其pH值稳定性，结果如图1所示。

由图1可知，pH值为5时，LOx游离酶的酶活随储存时间的延长缓慢下降，储存45 d后仍保留77%的酶活；其它pH值条件下，储存45 d后酶活可以保留90%以上。表明，LOx游离酶有较好的pH值稳定性。

图1 LOx游离酶的pH值稳定性Fig.1 pH value stability of free LOx

2.1.2 热稳定性

在pH值为7时，将LOx游离酶分别置于35～60 ℃水浴中保温1 h，考察LOx游离酶的热稳定性，结果如图2所示。

图2 LOx游离酶的热稳定性Fig.2 Thermal stability of free LOx

由图2可知，当温度低于50 ℃时，LOx游离酶的酶活保持稳定，无酶活损失；当温度升至60 ℃时，也仅有12%的酶活损失。表明，LOx游离酶具有较好的热稳定性。

2.2 LOx固定化条件优化

2.2.1 载体选择

向LOx游离酶液中加入终浓度为1 mol·L-1的磷酸氢二钾溶液，用磷酸氢二钾溶液调节pH值至7.0，按投料比4 000∶1加入载体ES-1或ECHA/S，25 ℃搅拌过夜，用pH值7.5的25 mmol·L-1磷酸盐缓冲液洗涤5次，测得ECHA/S固定化LOx和ES-1固定化LOx的酶活相差不大，分别为122.60 U·g-1和121.61 U·g-1。4 ℃下，2种固定化LOx的储存稳定性如图3所示。

由图3可知，4 ℃下，ES-1固定化LOx的酶活随储存时间的延长逐渐降低，77 d后仅保留9%的酶活；而ECHA/S固定化LOx的酶活几乎没有损失，77 d后仍保留98%的酶活。表明，ECHA/S氨基载体更适于LOx的固定化。

图3 固定化LOx的储存稳定性Fig.3 Storage stability of immobilized LOx

2.2.2 投料比选择

按2.2.1方法，分别按投料比500∶1、1 000∶1、2 000∶1、3 000∶1、4 000∶1、5 000∶1进行固定化，考察投料比对固定化LOx酶活的影响，结果如图4所示。

图4 投料比对固定化LOx酶活的影响Fig.4 Effect of material ratio on enzyme activity of immobilized LOx

由图4可知，当投料比为500∶1时，由于载体处于不饱和吸附状态，固定化LOx的酶活较低，相对酶活不足50%；随着酶投加量的增加，载体吸附逐渐趋于饱和，固定化LOx的酶活迅速升高；在投料比达到1 000∶1后，载体处于过饱和吸附状态，固定化LOx的酶活随着酶投加量的增加缓慢升高。因此，选择投料比为1 000∶1。

2.2.3 磷酸氢二钾浓度选择

一般情况下，酶的固定化需要适当盐浓度促进载体与酶分子的表面疏水作用，促使酶分子吸附于载体表面。按2.2.1方法，投料比为1 000∶1，向LOx游离酶液中分别加入终浓度为0 mol·L-1、0.50 mol·L-1、1.00 mol·L-1、1.25 mol·L-1的磷酸氢二钾溶液，考察磷酸氢二钾浓度对固定化LOx酶活的影响，结果如图5所示。

图5 磷酸氢二钾浓度对固定化LOx酶活的影响Fig.5 Effect of dipotassium phosphate concentration on enzyme activity of immobilized LOx

由图5可知，磷酸氢二钾浓度在0～1.00 mol·L-1时，固定化LOx的酶活无明显差异；当磷酸氢二钾浓度为1.25 mol·L-1时，固定化LOx的酶活显著下降。实验发现，加入磷酸氢二钾溶液后酶液瞬间变浑浊，推测为盐浓度过高导致酶的盐析。因此，LOx的固定化无需额外增加盐浓度，这样可大幅降低下游废水的处理难度，节约生产成本。

2.2.4 固定化温度选择

按2.2.1方法，投料比为1 000∶1，分别于20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃下进行固定化，考察固定化温度对固定化LOx酶活的影响，结果如图6所示。

图6 固定化温度对固定化LOx酶活的影响Fig.6 Effect of immobilization temperature on enzyme activity of immobilized LOx

由图6可知，固定化LOx的酶活随固定化温度的升高逐渐降低。可能是由于，酶的固定化使酶的刚性增加，随着固定化温度的升高，酶分子结构逐渐展开，与酶活相关的一些氨基酸残基逐渐暴露，从而被载体固定，导致酶活下降；还可能是由于，酶与氨基载体为共价结合方式，高温不利于共价键的形成[15]。固定化温度超过30 ℃后，固定化LOx的酶活急剧下降；40 ℃时酶活仅为20 ℃时的28%。因此，选择固定化温度为20 ℃。

2.2.5 固定化pH值选择

按2.2.1方法，投料比为1 000∶1，固定化温度为20 ℃，调节LOx游离酶液pH值分别为6、7、8、9进行固定化，考察固定化pH值对固定化LOx酶活的影响，结果如图7所示。

图7 固定化pH值对固定化LOx酶活的影响Fig.7 Effect of immobilization pH value on enzyme activity of immobilized LOx

由图7可知，固定化pH值对固定化LOx酶活无显著影响，pH值为7～8时，固定化LOx的酶活稍高，而游离酶pH值正好处于这个范围。因此，LOx固定化时无需特意调节pH值，这样可以避免pH值调节过程中造成酶失活的可能性，从而提高固定化LOx的使用稳定性。

综上，确定LOx的最优固定化条件为：使用ECHA/S氨基载体，投料比为1 000∶1，自然盐浓度，固定化温度20 ℃，固定化pH值7～8。

2.3 固定化LOx的催化性能及稳定性验证

经测定，固定化LOx的丙酮酸摩尔收率约为71%，与游离酶(约70%)相当。进行13批次反应后，固定化LOx酶活整体保持稳定(图8)，酶活无明显损失。固定化LOx在4 ℃下储存60 d和130 d后，相对酶活分别为102%和103%，酶活无损失。表明，制备的固定化LOx具有较好的使用稳定性和储存稳定性。

3 结论

将LOx在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中重组表达，经分离纯化后得到游离酶，该游离酶具有较好的pH值稳定性和热稳定性。采用ECHA/S氨基载体，在LOx游离酶与载体比例为1 000∶1(U∶g)、自然盐浓度、固定化温度为20 ℃、固定化pH值为7～8时，搅拌过夜固定，得到固定化LOx，该固定化LOx具有较好的使用稳定性和储存稳定性，转化13批次后，酶活无明显下降；4 ℃下储存130 d，无酶活损失。该固定化工艺简单，对设备要求低，仅需对固定化温度稍加控制，制备的固定化LOx酶活高、稳定性好、可多批次重复使用，为产业化应用提供了参考。

图8 固定化LOx的使用稳定性Fig.8 Use stability of immobilized LOx