甘卫泽，李益涛，曹梦园，李傲寒，张莉，齐亚银

(1.昌吉州动物疾病预防控制中心，昌吉 831100；2.石河子大学动物科技学院，石河子 832000；3.宁夏大学农学院，银川 750000）

奶牛乳房炎会给牧场带来弃奶、用药残留、乳品质下降以及传染牛只淘汰等重大损失，也可导致奶酪、凝乳等奶制品质量下降[1～3]。乳房炎的发生原因非常复杂，一般可分为机械、物理、化学、微生物、饲养管理等多种因素单个或共同作用产生。

导致奶牛乳房炎常见的病原菌主要有接触传染型病原菌（包括金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、牛支原体、牛棒状杆菌等），以及环境型病原菌（包括葡萄球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、原壁菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓隐秘杆菌、粘质沙雷氏菌、酵母菌、肠球菌等）。其中金黄色葡萄球菌是最常见的一种细菌，一旦感染很难彻底治疗，后期会转为慢性感染且耐药性极强，同时金黄色葡萄球菌还可以危及人类健康，对公共食品卫生安全造成一定的威胁[4,5]。

为此，本研究为了查明某规模化牧场奶牛乳房炎中金黄色葡萄球菌的感染及耐药现状，采集隐性乳房炎源乳样，采用常规微生物学结合16S rRNA 细菌鉴定的方法，进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定，同时对其药敏表型及耐药基因进行检测，以期为进一步制定有效防控措施提供科学指导意见。

1 材料与方法

1．1 材料

1.1.1 乳样来源

无菌采集812份乳样（经现场检测为隐性乳房炎），于4℃冷链保存运输至实验室备用。

1.1.2 主要试剂及药品

LB肉汤培养基、琼脂粉（上海生工生物工程股份有限公司）；甘露醇高盐琼脂（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）；革兰氏染色液（珠海贝索生物技术有限公司）；药敏纸片（头孢喹肟、环丙沙星、红霉素、阿奇霉素、青霉素、卡那霉素、头孢噻吩、多西环素、阿莫西林、氨苄西林、苯唑西林钠、头孢曲松，杭州滨和微生物试剂有限公司）。

1．2 菌株的筛选及鉴定

1.2.1 菌株的筛选及初步鉴定

无菌操作，将乳样接种于LB肉汤，37℃培养24h；然后采取连续划线的方法接种在甘露醇高盐培养基上，37℃培养24h，观察菌落形态。挑取黄色且周围有黄色环的菌落进行涂片、革兰氏染色、显微镜观察，同时将疑似菌株再次接种于甘露醇高盐培养基上用于再一次鉴定和纯化。

1.2.2 分离株的16S RNA鉴定

提取细菌D N A保存于-2 0℃备用。根据张蕾等[6]研究设计金黄色葡萄球菌1 6 S R N A的引物，大小为1 4 6 6 b p，其引物序列：上游引物16S-F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；下游引物16S-R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT。反应体系为20μL，其中2xEs Taq MsterMix10μL，ddH2O 7μL，上下游引物各1μL，细菌DNA模板1μL。

PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性45s，56℃退火45s，75℃延伸1.5min；30个循环；72℃终延伸10min。反应结束后取8～10μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测。

1．3 分离株的药物敏感性试验

1.3.1 分离株的药敏表型检测

根据纸片法（Kirby-Baure法）进行药敏实验。将分离培养的金黄色葡萄球菌菌落接种于肉汤培养基，于37℃培养至超过0.5麦氏单位，取出用盐水或肉汤调节菌液至0.5麦氏单位，含菌量（1～2）×108CFU/mL。无菌操作：在MH琼脂板上均匀涂菌，室温放置3～5min。用镊子取不同的药敏纸片，贴于琼脂表面，不同药敏纸片的间距至少24mm，在平板贴6张药敏纸片。将粘贴完药敏纸片的平板置35℃孵育18～24h后，测量抑菌圈直径。

参照美国临床实验室国家标准化管理委员会标准（CLSI2008）判定。

1.3.2 耐药基因的检测

设计耐四环素tetK基因、庆大霉素-卡那霉素aacA-aphD基因、利福霉素类rpoB基因、β-内酰胺类blaZ、norA基因、喹诺酮类sepA基因、消毒剂Smr-1、ade B基因的引物。具体引物序列和所查阅文献如表1所示。

表1 分离株耐药基因引物序列

具体反应程序如表2所示。

表2 各耐药基因PCR体系

2 结果与分析

2．1 分离株的初步鉴定及形态学特征

奶样在甘露醇高盐培养基上的菌落形态为黄色并且周围有黄色圆圈；菌液划线于甘露醇高盐的培养基上长出的菌落符合金黄色葡萄球菌的特性；金黄色葡萄球菌经革兰氏染色后在显微镜下呈球型，排列呈葡萄串状，无芽孢、鞭毛，无荚膜（图1）。

图1 分离株葡萄球菌形态学特征

2．2 PCR鉴定结果

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，产物大小与预期大小一致，为1 466bp（图2）。

图2 部分金黄色葡萄球菌16S RNA的PCR电泳结果图

2．3 药敏表型检测结果

表3 部分分离株的药敏实验结果

选取的105份样品中对头孢噻肟敏感的占46.67%，耐药的占33.33%，中介占20.00%；对环丙沙星敏感的占40.00%，耐药的占53.33%，中介的占6.67%；对红霉素敏感的占26.67%，耐药的占66.67%，中介的占6.67%；对阿奇霉素敏感的占13.33%，耐药的占60.00%，中介的占26.67%；对青霉素G敏感的占6.67%，耐药的占93.33%；对卡那霉素敏感的占40.00%，耐药的占46.67%，中介的占13.33%；对头孢噻吩敏感的占26.67%，耐药的占60.00%，中介的占13.33%；对强力霉素敏感的占40.00%，耐药的占60.00%；对阿莫西林敏感的占20.00%，耐药的占80.00%；对氨苄青霉素敏感的占13.33%，耐药的占86.67%；对苯唑青霉素敏感的占40%，耐药的占60.00%；对头孢曲松钠敏感的占53.33%，耐药的占13.33%，中介的占33.33%。具体结果如表3所示。

2．4 耐药基因检测结果

通过PCR检测其耐药基因结果：在新疆地区分离的105株金黄色葡萄球菌中，有6种毒力基因的检出率超过50%。其中blaZ为94.4%，norA为95.23%，rpoB为63.4%，ade B为54.2%，sepA为56.3%，tetK为61.1%；另外两种耐药基因的检出率Smr-1为40.95%，aacA-aphD为46.67%。

3 讨论

本试验根据国标中甘露醇高盐培养基筛选金黄色葡萄球菌的方法进行筛选，其中高浓度的氯化钠可以抑制其他菌种，检测结果与PCR一致，准确性高[13]。金黄色葡萄球菌的分离率为26.60%，为该牧场奶牛乳房炎的一个重要致病因素。目前临床上对奶牛乳房炎已有一定的预防手段，但其发病率仍是居高不下，尤其存在一些抗生素滥用的现象，导致金黄色葡萄球菌中存在很多的耐药基因，从而致使其产生耐药性，甚至是多重耐药性，这与本试验结果一致。本试验分离所得到的金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药程度最高，氨苄青霉素和阿莫西林的耐药比例也分别高达86.67%和80.00%，对红霉素耐药，对阿奇霉素、头孢噻吩、强力霉素、苯唑青霉素和环丙沙星耐药均在50%以上。这与周欣云等[14]研究结果类似，说明金黄色葡萄球菌普遍存在耐青霉素的现象。但与高攀[15]研究的新疆地区金黄色葡萄球菌耐药性有一定的差异，这可能与年份不同、采样地点差异有一定的关系。但其与本试验耐药基因的检出率和药敏实验结果类似，可为临床用药提供一定的指导依据。建议在进行乳房炎的治疗时，应采取轮换用药或选择敏感性较高的药物。

金黄色葡萄球菌具有传染性较强、环境耐受能力强和抵御外部压力的能力较强等特点[16]。在牧场中往往通过卧床、挤奶器械传播，所以生产中应该加强环境、公用器械的消毒。同时也应通过加强奶牛的日常管理来增强奶牛自身的免疫力，注意饲养管理、精料比、挤奶管理等环节。同时也应注意干奶期的乳房炎预防，建议干奶时每头牛必须进行隐性乳房炎检测，然后根据分离的菌株进行药物治疗并配合干奶针预防，降低金黄色葡萄球菌的感染风险。该牧场通过淘汰金黄色葡萄球菌阳性牛、干奶时采取“乳畅治疗+安倍宁干奶”的方式，取得了很好的效果。