张秀军 么春艳 陶晓东 孙金军

急性肺损伤（ALI）是危及生命的呼吸衰竭疾病，由原发性肺炎、胸膜脓毒症、吸入性肺炎等引起[1]。尽管ALI 的治疗策略已取得较大进步，但ALI 在败血症相关的重症患者中仍有较高的死亡率[2-3]。研究表明，LPS 诱导小鼠ALI 模型中，活性氧（ROS）的大量产生抑制核因子E2 相关因子2（Nrf2）/醌氧化还原酶（NQO1）抗氧化信号，促进炎症因子分泌，产生严重的炎症反应[4]。近年来，微小RNA（miRNAs）已被建议作为ALI 的诊断生物标志物或治疗靶标[5]。研究发现，miRNA 破坏ROS 的产生（下游介体），并参与ROS 介导的氧化应激反应[6]。然而miRNA 能否通过调控ROS 诱导的氧化应激反应参与ALI 进程尚不明确。miR-28-5p 位于染色体3q28 上，在多种肿瘤发生发展中表达上调，起到促进肿瘤的作用[7-8]，并参与炎症以及氧化还原反应[9]。基于此，本研究将明确miR-28-5p 在ALI 中的功能和作用机制，为ALI 靶向治疗提供理论依据。

1 实验材料

1.1 动 物 C57BL/6 小鼠（SPF 级），雄性，7～8 周龄，22～25g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018-0006。小鼠饲养于SPF 级屏障中，明暗各12h，给予充足食物和无菌水。本实验研究经杭州医学院实验动物伦理委员会审核通过（审批号：20190170）。

1.2 细胞株 小鼠巨噬细胞RAW264.7 细胞株购自中国科学院细胞库（目录号SCSP-538）。培养条件：含10%FBS 的1640 培养基，加1%PSG 双抗。待细胞汇合度达到80%时传代至20%。

1.3 试 剂 RPMI-1640 基础培养基（批号025646）、胎牛血清（批号5737）购自美国CORNING 公司；脂多糖（LPS）（批号46683）购自美国Sigma 公司；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（批号2385）、白介素-1β（IL-1β）（批号18844456）等炎症因子检测试剂盒购自上海翊盛生物科技有限公司。Nrf2 兔单抗（批号795564）、血红素加氧酶（HO-1） 兔单抗（批号238964）、NQO1 兔单抗（批号454529）均购自美国CST 公司。GAPDH 作为内参。

1.4 仪 器 iD5 多功能微孔板读板机（酶标仪），美谷分子仪器（上海） 有限公司；1300 Series A2 Biological Safety Cabinet Packages 生物安全柜，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；CFX96 Touch 荧光定量PCR 仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Odyssey TMLi-COR 检测系统，上海基因有限公司；Thermo fisher -80℃超低温冰箱，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

2 实验方法

2.1 小鼠ALI 模型构建 将40 只SPF 级C57BL/6雄鼠按照随机数字表法分为四组，分别为生理盐水组、ALI-3h 组、ALI-6h 组、ALI-12h 组，每组10 只。造模组通过气道滴入LPS 1.5mg/kg，诱导3h（ALI-3h组）、6h（ALI-6h 组）、12h（ALI-12h 组）后分批处死小鼠，生理盐水组气道滴注等体积生理盐水。利用生理盐水灌洗抽取支气管肺泡灌洗液，取一叶肺组织用于提取RNA。

2.2 支气管肺泡灌洗液中细胞因子含量测定 将分离出来的小鼠肺泡灌洗液，300rpm，4℃离心10min后，去上清，利用ELISA 试剂盒，按说明书要求，测定上清中TNF-α、IL-1β 含量。

2.3 小鼠肺巨噬细胞株RAW264.7 培养与处理 培养条件：CORNING RPMI 1640 培养基+10% FBS。培养至汇合度达到80%时传代培养。将RAW264.7铺板于24 孔板，利用10mM 的LPS 分别刺激3、6、12h 后收集细胞上清液，同样采用ELISA 试剂盒，按说明书要求，测定上清液TNF-α、IL-1β 的含量。收集蛋白利用RIPA 中裂解液裂解蛋白，经离心后测定蛋白浓度，加入loading 100℃煮8min，上样检测Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白表达水平。提取RNA 利用TRIzol 法裂解，经逆转为cDNA 后进行荧光定量PCR（RT-PCR）。

2.4 设计miR-28-5p mimic，转染巨噬细胞 miR-28-5p mimic 和对应的mimic-NC 购自QIAGEN，利用QIAGEN 提供HiPerFect Transfection Reagent 进行miRNA Mimic 转染。转染24h 后进行后续试验。

2.5 RT-PCR 检测miR-28-5p、TNF-α、IL-1β、Nrf2、HO-1、NQO1 表达水平 对于肺组织样，将组织剪碎后加入TRIzol 进行匀浆。对于细胞，直接加入TRIzol裂解细胞，并利用三氯甲烷-异丙醇-乙醇进行分离提取，逆转为cDNA 后进行荧光定量PCR。PCR 引物如下：miR-28-5p：5'-AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG-3'；TNF-α（Forward：5'-CAGGCGGTGCCTATGTCTC-3'，Reverse：5'-CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG-3'）；IL-1β（Forward：5'-GAAATGCCACCTTTTGACAGTG-3'，Reverse：5'-CTGGATGCTCTCATCAGGACA-3'）；Nrf2（Forward：5'-GGCGTTAGAAAGCATCCTTCC-3'，Reverse：5'-GCAGAGGGCACACTCAAAGT-3'）；HO-1（Forward：5'-ATGACACCAAGGACCAGAGC-3'，Reverse：5'-GTGTAAGGACCCATCGGAGA-3'）；NQO1（Forward：5'-TCACCACCTACTTTGCTCCAA-3'，Reverse：5'-TTTTTCGCTCCTCTTGAACCT-3'）。上述引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成。

2.6 Western bolt 检测Nrf2、HO-1、NQO1 蛋白水平 提取ALI 小鼠肺组织蛋白时，将组织剪碎后加入RIPA 强裂解液裂解，经过离心后测定上清液蛋白浓度。提取细胞蛋白时，将细胞上清吸取后加入PBS 洗一遍，加入RIPA 中裂解液裂解蛋白，离心测定蛋白浓度。收集好蛋白样后进行凝胶电泳，过夜孵育一抗后，室温孵育荧光二抗1h，利用荧光扫膜仪扫膜。

2.7 统计学方法 应用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 miR-28-5p 在LPS 诱导的小鼠ALI 模型肺组织表达 利用LPS 气道滴入诱导ALI 病理模型后，分别在0、3、6、12h 收集小鼠支气管肺泡灌洗液和肺组织。与生理盐水组相比，LPS 刺激3、6、12h 后支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β 含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明ALI 模型构建成功，且3h 时TNF-α、IL-1β 含量增加最明显（P＜0.05）。随后利用肺组织RNA 检测miR-28-5p 表达，与生理盐水组相比，LPS 刺激3、6、12h 后肺组织miR-28-5p表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），且在3h时miR-28-5p 表达升高最明显（P＜0.05），与TNF-α、IL-1β 含量升高趋势一致。见表1-2。

表1 LPS 造模不同时间点肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β相对含量（）

表1 LPS 造模不同时间点肺泡灌洗液TNF-α、IL-1β相对含量（）

注：生理盐水组为生理盐水处理小鼠；ALI-3h 组为LPS 诱导小鼠ALI 3h；ALI-6h 组为LPS 诱导小鼠ALI 6h；ALI-12h 组为LPS 诱导小鼠ALI 12h；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素1β；ALI 为急性肺损伤；LPS 为脂多糖；与生理盐水组比较，aP＜0.05；与ALI-3h组比较，bP＜0.05

3.2 LPS 刺激巨噬细胞后miR-28-5p 表达 利用LPS 刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7 诱导细胞发生M1 型极化。与生理盐水组相比，LPS 刺激3、6、12h后细胞上清液TNF-α、IL-1β 含量均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），表明LPS 刺激后巨噬细胞发生了M1 型极化。同时检测LPS 刺激巨噬细胞后miR-28-5p 表达水平，发现与生理盐水组相比，巨噬细胞内miR-28-5p 表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与ALI-3h 组比较，ALI-6h 组和ALI-12h组细胞上清液TNF-α、IL-1β 及胞内miR-28-5p 水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3-4。

表2 LPS 造模不同时间点肺组织miR-28-5p相对表达（）

表2 LPS 造模不同时间点肺组织miR-28-5p相对表达（）

注：生理盐水组为生理盐水处理小鼠；ALI-3h 组为LPS 诱导小鼠ALI 3h；ALI-6h 组为LPS 诱导小鼠ALI 6h；ALI-12h 组为LPS 诱导小鼠ALI 12h；miR-28-5p 为微小RNA28-5p；ALI 为急性肺损伤；LPS 为脂多糖；与生理盐水组比较，aP＜0.05；与ALI-3h 组比较，bP＜0.05

表3 LPS 处理巨噬细胞不同时间点细胞上清液TNF-α、IL-1β 相对含量（）

表3 LPS 处理巨噬细胞不同时间点细胞上清液TNF-α、IL-1β 相对含量（）

注：生理盐水组为生理盐水处理小鼠；ALI-3h 组为LPS 诱导小鼠ALI 3h；ALI-6h 组为LPS 诱导小鼠ALI 6h；ALI-12h 组为LPS 诱导小鼠ALI 12h；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素1β；ALI 为急性肺损伤；LPS 为脂多糖；与生理盐水组比较，aP＜0.05；与ALI-3h组比较，bP＜0.05

表4 LPS 处理巨噬细胞不同时间点miR-28-5p相对表达（）

表4 LPS 处理巨噬细胞不同时间点miR-28-5p相对表达（）

注：生理盐水组为生理盐水处理小鼠；ALI-3h 组为LPS 诱导小鼠ALI 3h；ALI-6h 组为LPS 诱导小鼠ALI 6h；ALI-12h 组为LPS 诱导小鼠ALI 12h；miR-28-5p 为微小RNA28-5p；ALI 为急性肺损伤；LPS 为脂多糖；与生理盐水组比较，aP＜0.05；与ALI-3h 组比较，bP＜0.05

3.3 miR-28-5p mimic 促进巨噬细胞M1 型极化设计miR-28-5p mimic 后转染巨噬细胞，检测结果显示miR-28-5p mimic 表达水平升高（P＜0.05）（见表5），提示miR-28-5p mimic 转染成功。随后检测巨噬细胞TNF-α、IL-1β mRNA 表达水平，结果显示，与mimic-NC 组比较，miR-28-5p mimic 过表达明显增强TNF-α 和IL-1β 水平，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示巨噬细胞中miR-28-5p 可能发挥着促炎作用，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表5 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

表5 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

注：mimic-NC 组为转染mimic-NC 对照巨噬细胞；miR-28-5p mimic为转染miR-28-5p mimic 巨噬细胞；miR-28-5p 为微小RNA28-5p；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-1β 为白细胞介素1β；与mimic-NC 组比较，aP＜0.05

3.4 miR-28-5p 促进Nrf2 及其信号表达 与生理盐水组比较，LPS 刺激巨噬细胞后Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。而在巨噬细胞中转染miR-28-5p mimic 后，同样Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 表达明显上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示miR-28-5p 可能通过调控Nrf2 及其下游HO-1、NQO1 的表达，介导了巨噬细胞的极化和炎症因子的分泌（见表6-7）。Western bolt 结果进一步验证了这一结论。见图1。

表6 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

表6 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

注：生理盐水组为生理盐水处理细胞；LPS 组为LPS 处理细胞3h；LPS为脂多糖；miR-28-5p 为微小RNA28-5p；Nrf2 为氧化关键分子核因子E2 相关因子2；HO-1 为血红素加氧酶；NQO1 为醌氧化还原酶；与生理盐水组比较，aP＜0.05

表7 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

表7 RT-PCR 检测各组RNA 表达水平（）

注：mimic-NC 组为转染mimic-NC 对照巨噬细胞；miR-28-5p mimic为转染miR-28-5p mimic 巨噬细胞；miR-28-5p 为微小RNA28-5p；Nrf2 为氧化关键分子核因子E2 相关因子2；HO-1 为血红素加氧酶；NQO1 为醌氧化还原酶；与mimic-NC 组比较，aP＜0.05

3.5 miR-28-5p 靶向Nrf2 基因3'UTR 序列 为进一步了解miR-28-5p 的靶基因，我们通过Targetscan 7.0 分析，得到miR-28-5p 靶向Nrf2 的3'UTR 序列（见表8）。后续通过突变Nrf2 3'UTR 中miR-28-5p结合位点，利用荧光素酶报告基因系统检测miR-28-5p 对Nrf2 转录水平的调控，结果显示，与mimic-NC+Nrf2 WT 组比较，miR-28-5p mimic+Nrf2 WT组的荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而同时共转染miR-28-5p mimic 和Nrf2 MUT 后，这种抑制效果得到了回复，见表9。

表8 Targetscan 预测miR-28-5p 靶向Nrf2 基因3'UTR 序列

图1 miR-28-5p 对巨噬细胞Nrf2 信号的影响

表9 荧光素酶报告基因检测miR-28-5p 对Nrf2 转录调控（）

表9 荧光素酶报告基因检测miR-28-5p 对Nrf2 转录调控（）

注：mimic-NC+Nrf2 WT 组为巨噬细胞共转染mimic-NC 和Nrf2 WT；miR-28-5p mimic+Nrf2 WT 组为巨噬细胞共转染miR-28-5p mimic 和Nrf2 WT；mimic-NC+Nrf2 MUT 组为巨噬细胞共转染mimic-NC 和Nrf2 MUT；miR-28-5p mimic+Nrf2 MUT 组为巨噬细胞共转染miR-28-5p mimic 和Nrf2 MUT；ns 为差异无统计学意义；与mimic-NC+Nrf2 WT 组比较，aP＜0.05

4 讨论

近年多项研究提示，miRNAs 可作为ALI 疾病诊断和风险评估更好的生物标志物[10-11]。Liu 等[12]研究表明，miR-155 在急性炎症性肺损伤中活跃表达。此外，若干miRs，包括miR-574，miR-486-5p 和miR-495 在ALI 中发挥着重要的调控作用[13-15]。提示miRs在ALI 发生发展过程中发挥着重要的调控作用，然而miR-28-5p 在ALI 中的作用尚未报道。为了探究miR-28-5p 在ALI 中的作用，利用LPS 构建小鼠ALI 模型，体外利用LPS 刺激巨噬细胞M1 型极化，结果均显示，miR-28-5p 在LPS 诱导的ALI 中表达升高，可能促进ALI 过程炎症的发生。为进一步验证，我们在巨噬细胞中过表达miR-28-5p mimic，结果显示，过表达miR-28-5p mimic 后，巨噬细胞分泌的炎症因子TNF-α 和IL-1β 水平明显升高。

Nrf2 是一种转录因子，可促进调节氧化应激、异源生物代谢和排泄、炎症、细胞凋亡、自噬和细胞生物能的基因表达。大量研究表明，Nrf2 激活在针对ALI/ARDS 的保护中非常重要[16-17]。NQO1 是主要的Nrf2 下游靶基因之一，被认为是主要抗氧化剂[18]。有趣的是NQO1 启动子区域参与ALI，NQO1 表达上调以响应氧化应激，NQO1 表达的增加可以预防高氧性肺损伤[19]。本研究通过Targetscan 预测发现，miR-28-5p 直接靶向Nrf2 基因3'UTR 序列，进一步通过荧光素酶报告基因验证了预测结果。我们在巨噬细胞中过表达miR-28-5p mimic 检测Nrf2 的表达及其下游蛋白HO-1、NQO1 的表达，结果显示过表达miR-28-5p mimic 后，Nrf2 的表达及其下游蛋白HO-1、NQO1 的表达明显下调，进一步证明了miR-28-5p 可能通过调控了Nrf2/HO-1/NQO1 信号参与调控ALI过程中巨噬细胞的炎症反应。

综上，本研究表明miR-28-5p 上调通过增加炎症因子的分泌在ALI 疾病中起促进作用。同时，发现miR-28-5p 负调控Nrf2 转录因子。因此，miR-28-5p与Nrf2 信号通路结合可能有助于更好地了解ALI的预防机制，有望成为ALI 潜在的生物标志物。