张通，杨平，魏健昌，曾山崎，陈华翠，钟俊斌，王强，李旺林，魏芳，曹杰

(广州市第一人民医院/广州消化疾病中心/华南理工大学附属第二医院 结直肠肛门外科，广东 广州 510180)

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一，严重危害人类健康，在世界范围内成为第4位致死的肿瘤性疾病[1]。我国CRC发病率和死亡率均位于所有肿瘤第5位[2]。手术、化疗和放疗是CRC的主要治疗手段，但CRC患者的总生存率却没有显著提高，亟待寻找新的治疗手段[3]。肿瘤和免疫反应的相互作用在肿瘤发生发展中具有重要作用[3-4]，增强和促进人体免疫反应对肿瘤患者来说是一种有效的治疗手段[5]。TIM家族在肿瘤微环境中调节先天及后天免疫细胞，有助于肿瘤的免疫监视和抗肿瘤的免疫反应，从而提高肿瘤的临床治疗效果[6]。TIMD4是TIM家族成员之一[6]。研究显示，TIMD4能够调节免疫功能及抗肿瘤的免疫反应，通过抑制肿瘤相关抗原活性，引起肿瘤微环境免疫耐受，从而抑制免疫活性[7-9]。本研究旨在进一步探讨TIMD4蛋白在CRC中的表达情况及其临床意义，为今后患者预后的预测和临床干预效果的评价提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料The cancer genome atlas(TCGA)数据库。组织芯片(No. co2161)包含208例结肠癌和8例正常结肠组织，购买于中国西安艾丽娜生物科技有限公司，附有所有患者的相关临床资料。PV-6000通用型免疫组化试剂盒购自北京欣兴唐生物科技有限公司，DAB显色液购自福州迈新试剂。兔抗人多克隆TIMD4抗体(HPA015625)购买于美国Sigma公司。光学显微镜购买于日本Olypmus公司。PBS缓冲液、苏木精、酒精，二甲苯、封片用树胶由广州市第一人民医院病理科提供。

1.2 免疫组化采用免疫组化PV两部法：组织芯片常规脱蜡至水，蒸馏水洗，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)浸泡5 min，微波微火抗原修复3 min，共2次，自然冷却至室温，体积分数为3%的过氧化氢封闭内源性过氧化物酶活性，10 min，PBS冲洗，以1∶100比例滴加TIMD抗体，4 ℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗滴加通用型二抗(PV-6000)，37 ℃温箱孵育40 min，PBS冲洗，二氨甲联苯胺显色，自来水充分冲洗，苏木精复染，酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

1.3 表达评分组织芯片扫描后使用ImageScope 11软件分析，2名病理医生分别以半定量方式对TIMD4表达进行评分。染色强度评定：无为0分，弱为1分，中为2分，强为3分。染色百分比：0～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，75%～100%为4分。总分由染色强度和百分比得分相加确定。总分>4分为高表达，总分≤4分为低表达[7]。

1.4 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析。TIMD4表达水平和临床病理特征的关系采用Mann-WhitneyU检验和χ2检验。总生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验。单因素和多因素分析采用Cox回归。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1TIMD4mRNA表达与CRC侵犯层次的关系TIMD4mRNA高表达与较深CRC侵犯层次相关(P=0.020)。TIMD4蛋白高表达与低病理分级(P=0.046)、高临床分期(P<0.001)、深侵犯层次(P<0.001)、有淋巴结转移(P<0.001)、有远处转移(P=0.001)相关。见表1。

2.2 CRC中TIMD4蛋白表达的情况采用免疫组化检测CRC组织芯片(208例癌组织、8例正常组织)TIMD4蛋白表达，进一步探讨TIMD4蛋白表达及其与患者临床病理特征之间的关系。图1A示组织芯片中各样本TIMD4蛋白表达情况。组织芯片原有208例CRC组织，免疫组化染色过程中部分CRC脱蜡，最终实验获得197例CRC染色。TIMD4蛋白在CRC中表达高于正常组织(P<0.01)(图1B)。图1C～1E显示TIMD4蛋白主要表达于CRC和正常组织肠上皮细胞的细胞质。

2.3 TIMD4高表达是CRC患者预后不良的独立风险因素采用Kaplan-Meier方法比较TCGA数据库192例CRC患者中TIMD4高表达和低表达患者的总体生存时间。根据TIMD4mRNA表达量平均值将样本分为TIMD4高表达组和低表达组[10]。TIMD4高表达组和低表达组患者术后的总生存时间分别为(40.10±6.75)和(48.54±2.95)个月。TIMD4高表达CRC患者术后总生存时间较TIMD4低表达者短(Log-rank=4.549，P=0.033)。见图2。单因素分析显示，TIMD4高表达是CRC患者预后不良的风险因素(HR：2.272，95% CI：1.041～7.116，P=0.041)。多因素分析进一步表明，TIMD4高表达是CRC患者预后不良的独立风险因素(HR：2.813，95% CI：1.013～7.811，P=0.047)。见表2。

表1 TIMD4表达与CRC患者临床病理特征关系

A为组织芯片染色图像；B为CRC中TIMD4蛋白表达高于正常组织(P<0.01)；C为TIMD4在CRC中高表达(免疫组化染色，×100，×400)；D为TIMD4在CRC中低表达(免疫组化染色，×100，×400)；E为TIMD4在正常组织中低表达(免疫组化染色，×100，×400)。

图2 TIMD4高低表达对结直肠癌患者生存的影响

表2 Cox比例风险回归模型分析TIMD4在CRC中的预后价值

3 讨论

目前，结直肠癌发病率及死亡率较高，严重威胁人类健康，虽然对其治疗方法及策略已有极大改善，但预后不良仍然成为亟待解决的临床问题[11]。机体细胞免疫系统主要通过识别肿瘤细胞，将肿瘤抗原呈递给T细胞，激活T细胞以及对肿瘤细胞特异性杀伤[12-13]。在此过程中，激活T细胞需要协同刺激信号的协助，这些刺激信号需要“免疫检查点”进行调控。目前关于免疫检查点关注较多的有TIM家族和PD-1等，此类分子在肿瘤微环境免疫调节中起到至关重要的作用[14]。

TIM-4是TIM家族的一员，主要作为磷脂酰丝氨酸受体，促进凋亡细胞的吞噬[15-16]。研究表明，TIM-4能抑制TIM-4缺陷小鼠的炎症反应并维持免疫耐受，这意味着TIM-4可能在肿瘤微环境中的免疫反应调节中发挥潜在作用[17]。在B16黑色素瘤小鼠模型的实验中，TIMD4单克隆抗体能够增强其抗癌反应，且TIMD4和TIM3单克隆抗体联合使用可以进一步提高疫苗诱导的抗肿瘤活性[18]。在胃癌的体内外实验中，阻断TIMD4和TIM1的相互作用能够增强免疫应答反应[19]。但TIMD4在CRC中的表达和作用尚缺乏深入研究。因此，本研究首先通过分析TCGA数据库，发现TIMD4mRNA高表达与较深CRC侵犯层次相关。有研究报道，非小细胞肺癌患者中TIMD4的高表达与临床预后不良显著相关[20]。Yano等[21]发现肾细胞恶性肿瘤中高表达TIMD4提示临床预后不良。本研究进一步分析TIMD4与结直肠癌患者临床病理资料之间的关系，证明CRC中TIMD4蛋白表达高于正常组织，TIMD4蛋白高表达与低病理分级、高临床分期、深侵犯层次、有淋巴结转移、有远处转移相关，此结果与Tan等[22]相关研究结果相似。基于上述研究结果，推测TIMD4在肿瘤组织中高表达对患者预后具有一定预测价值，采用Kaplan-Meier生存分析法比较肿瘤组织中TIMD4表达与患者生存情况，研究结果显示，TIMD4高表达的CRC患者术后总生存时间较TIMD4低表达者短，两者生存情况差异有统计学意义。TIMD4在肿瘤的发生、发展过程中可能发挥负调节作用，可能由于TIMD4高表达引起机体T细胞功能障碍，从而导致肿瘤免疫逃逸作用。本研究结果显示，结直肠癌中TIMD4高表达可作为CRC患者预后不良的独立风险因素。

综上所述，TIMD4在CRC组织中表达增加，且与患者组织学分型、肿瘤分期、淋巴结转移、远处转移密切相关，且CRC中TIMD4高表达患者提示临床预后不良。因此，TIMD4有望成为结直肠癌免疫治疗靶向调控的一个重要靶点，也有望成为结直肠癌早期分子诊断与预后评估的重要分子。