赵艳侠，吴新颖，王鹏飞，亓桂梅

(山东省葡萄研究院 农业农村部华东都市农业重点实验室，山东 济南 250100)

褪黑素是一种吲哚胺类激素，1958年首次从牛的松果体中分离出来，并鉴定出其化学结构[1]。在植物界中，1991年首次在单细胞藻类(Gonyaulaxpolyedra)中鉴定出褪黑素，之后又在洋葱、菠萝、卷心菜、黄瓜、草莓等多种植物中鉴定和检测到褪黑素[2]。褪黑素具有抗氧化的性质，可以清除有机体内的活性氧和活性氮自由基[3-4]。目前，动物中褪黑素合成路径已经比较清楚，由色氨酸脱羧酶(TDC)、色胺-5-羟化酶(T5H)、5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(SNAT)、N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶(ASMT)4种酶参与酶促反应将色氨酸转化为褪黑素[5]，但是植物中褪黑素合成路径还尚不明确，目前已知植物中五羟色胺是褪黑素的合成前体[6]，褪黑素代谢产物有2-羟基褪黑素(99%)、4-羟基褪黑素、6-羟基褪黑素[7]。这些代谢产物的相同点是褪黑素的合成前体物质都是色氨酸[8]，但是在植物上合成路径更为复杂，不仅仅有TDC、T5H、SNAT和ASMT参与酶促反应，还存在色氨酸羟化酶(TPH)等参与其他合成通路[9-10]。SNAT基因在褪黑素的合成路径中能够催化五羟色胺转化成N-乙酰-5-羟色胺。不同植物SNAT的氨基酸序列均具有一定的同源性，而褪黑素合成路径中TDC、T5H、ASMT基因在不同植物中序列保守性较低[11]，葡萄上褪黑素合成关键酶基因VvTDC、VvSNAT等已经得到克隆，但在葡萄上褪黑素合成关键基因的组织定位及亚细胞定位分析还不明确。目前只发现褪黑素生物合成途径中间产物存在于细胞质、内质网、叶绿体等亚细胞组分中[12]。

许多报道表明，褪黑素不仅具有抗氧化性，而且能够减轻环境胁迫的影响，如温度、干旱、紫外线-B(UV-B)和重金属污染等。与此同时，也发现环境胁迫可增加植物内源褪黑素的含量。对褪黑素在葡萄上的含量、分布及功能等研究进展进行综述，为褪黑素在葡萄上应用和系统研究提供一定理论参考。

1 不同品种和发育时期葡萄褪黑素含量

1.1 品种

褪黑素在不同葡萄品种中的含量存在差异。2006年 IRITI等[13]首次利用高效液相色谱法(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)测定内比奥罗(Nebbiolo)、克罗蒂娜(Croatina)、桑娇维赛、美乐、玛泽米诺(Marzemino)、品丽珠、赤霞珠和巴贝拉(Barbera)等8个不同品种葡萄果皮中褪黑素的浓度，结果显示，不同葡萄品种果皮中的褪黑素含量存在差异，含量为0.005～0.965 ng/g，褪黑素含量较高的2个品种是内比奥罗(0.965 ng/g)和克罗蒂娜(0.870 ng/g)。STEGE等[14]则利用毛细管层析方法检测马贝克、赤霞珠、霞多丽葡萄果皮中褪黑素含量分别为0.6、0.8、1.2 ng/g。卞凤娥[15]测定12个葡萄品种成熟果皮中褪黑素含量，结果发现，大部分含量在1 ng/g以内，美乐葡萄果皮中的褪黑素含量最高，其次是马贝克、威代尔等，而摩尔多瓦、早巨峰、香百川等含量较低。总的来说，大多数葡萄中的褪黑素含量存在品种间差异。

1.2 发育时期

葡萄不同发育时期的内源褪黑素含量不同，在果实的不同发育阶段均检测到褪黑素的存在，且褪黑素含量表现出明显差异。一般而言，葡萄转色前的绿果期褪黑素含量相对较高，随着果实转色褪黑素含量升高，转色初期果实中褪黑素含量达到最高峰，随着果实完全转色褪黑素含量下降，随着果实逐渐成熟又表现出上升的趋势。其合成前体物质——色胺和五羟色胺含量变化趋势与褪黑素一致，均在转色初期含量最高[16]，而种子中的褪黑素含量在转色期达到最高[17]。果实的成熟程度也对褪黑素含量存在一定的影响，葡萄上褪黑素合成关键酶基因VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3在果实发育过程中表达量变化趋势相似，在果实转色初期表达量达到最高峰，转色后期表达量下降，随着果实逐渐成熟，VvSNAT1、VvSNAT2、VvSNAT3表达量又上升，这3个基因在葡萄果实发育过程中的表达量与褪黑素含量变化趋势基本一致[18]。

2 褪黑素在葡萄生长发育中的作用

越来越多的证据表明，褪黑素调控植物多种生理过程，如种子萌发、生长发育、果实成熟以及采后成熟和果实质量改善等[19-24]。褪黑素对葡萄的生长有促进作用，葡萄幼果喷施褪黑素溶液，可引起葡萄果实内源褪黑素积累，促进果实膨大[25]。外源褪黑素处理能极显著提高果实内源褪黑素含量，提高总花青苷和可溶性固形物含量，降低可滴定酸含量，表明褪黑素促进葡萄果实成熟[20]。葡萄中褪黑素的合成存在昼夜节律现象，尤其是光和温度也能够影响植物体内褪黑素的合成与积累[26]。BOCCALANDRO等[27]分析不同时间段葡萄果实中褪黑素含量，发现黎明之前果实中含量最高，可能受光照和温度的影响，夜间褪黑素含量高于白天。发育的花和种子存在高浓度的褪黑素，可以起到保护生殖器官的作用，褪黑素含量随着美乐葡萄果实的成熟不断增加[18]。

3 褪黑素在葡萄抗性调控中的作用

葡萄中褪黑素的合成是其对逆境胁迫的一种应激响应，褪黑素在缓解逆境胁迫方面具有重要作用。葡萄通过调节逆境胁迫下叶片光合速率、气孔导度、细胞膜离子渗透率和细胞中抗氧化酶活性等生理特性，提高抵御胁迫的能力[28-30]。

3.1 参与盐碱胁迫调控

盐碱胁迫是一种限制葡萄生长和生物合成的重要非生物胁迫。研究发现，盐胁迫后，葡萄根系中褪黑素含量大幅度下降，嫩枝中五羟色胺含量增加，胁迫严重抑制葡萄叶片光系统活性；根施外源褪黑素后与单纯的盐胁迫相比，促进褪黑素在葡萄不同器官中代谢和分布，显著提高叶片中五羟色胺含量和新根褪黑素含量，提高嫩梢和叶片中2-羟基褪黑素含量，褪黑素缓解叶片光系统活性抑制程度，减轻盐胁迫对葡萄叶片光合作用的伤害程度，有效提高逆境胁迫下叶片光合色素含量和光合能力[31-32]。与受盐胁迫类似，葡萄受碱胁迫后，葡萄根、茎和叶中的褪黑素含量降低，葡萄根系中褪黑素代谢前体物质五羟色胺含量显著增加，褪黑素的代谢产物2-羟基褪黑素含量在根中大幅降低，在叶片中大量积累，调节有机渗透调节物质含量，碱胁迫下外源褪黑素显著降低了叶片超氧阴离子自由基产生速率和H2O2含量，增加有机渗透调节物质，如可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量，通过上调离子转运蛋白VvNHXP和VvHKT家族基因的表达，维持胞内离子平衡，缓解碱对膜系统的伤害[33]。另外，外源褪黑素处理可以清除碱胁迫下葡萄根中过量活性氧的累积，维持膜系统的完整性，提高根系活力，缓解碱胁迫对葡萄叶片叶绿素的降解以及光系统(PSⅡ)活性的抑制[34]。在盐碱胁迫情况下，葡萄根系和叶片中的褪黑素对葡萄抵抗盐碱胁迫起到重要的作用。

3.2 参与水分胁迫调控

干旱胁迫下，葡萄幼苗根系和叶片中褪黑素含量是正常生长条件下幼苗根系和叶片中褪黑素含量的7倍，增加显著；10% PEG-6000处理植株后其根系和叶片中褪黑素含量也远高于空白对照组，且胁迫程度越强增幅越大[35]。MENG等[36]发现，外源添加褪黑素可以缓解干旱胁迫对葡萄幼苗的伤害，还发现褪黑素能保护干旱胁迫下葡萄叶绿体膜结构和基粒片层结构，增加叶片厚度和栅栏组织紧实度，并调控气孔关闭以降低水分散失。外源褪黑素可以提高干旱胁迫下葡萄内源褪黑素含量及其关键代谢物五羟色胺与2-羟基褪黑素含量，缓解胁迫对叶片光抑制的作用[37]。

3.3 参与温度和臭氧胁迫调控

研究发现，根施褪黑素可显著缓解葡萄叶片净光合速率及最大光化学效率的下降程度，改善高温胁迫下葡萄叶片的能量分配，增加叶片对光能的利用效率，有助于提高葡萄的耐热性[25]。外源褪黑素在防御葡萄霜冻中也发挥作用，在轻度低温胁迫下喷施褪黑素可以减轻葡萄叶片受冻程度，减轻葡萄叶片细胞膜脂质过氧化程度，保护膜的完整性，减少电解质的外渗，效果与碧护(植物生长调节剂)及天达(植物细胞膜稳态剂)类似[38]。耿庆伟等[30]研究显示，外源褪黑素提高臭氧胁迫下葡萄叶绿素a、b和类胡萝卜素含量以及叶绿素a/b值，通过调节光系统的能量分配，缓解臭氧胁迫下叶片的氧化损伤程度，提高光保护机制，保护叶片光合功能。

4 褪黑素与其他激素的协同作用

褪黑素在结构上与植物激素IAA(吲哚-3-乙酸)相似，同为吲哚胺类化合物，褪黑素和生长素的生物合成途径具有相同的前体色氨酸[5,8]，其共同的前体物质色氨酸可用于产生更多的褪黑素，降低生长素的合成，从而发挥调控果实发育的作用[39-40]，所以一些研究围绕着生长素在生长发育过程中的作用展开。研究发现，褪黑素及其前体物质五羟色胺促进根系生长，与生长素作用模式类似[41],促进下胚轴的生长类似于IAA[40]。目前在葡萄上关于褪黑素与其他激素的交互研究较少。许丽丽等[42]在葡萄上展开一些研究，发现褪黑素处理显著诱导乙烯生化合成和信号传导关键基因的表达水平，提高转色期葡萄果实中乙烯前体物质1-氨基环丙烷羧酸(ACC)含量和乙烯释放速率，对ABA(脱落酸)含量未产生显著影响。褪黑素可能与乙烯相互作用促进了葡萄果实的成熟。转录组测序分析发现，外源褪黑素处理诱导葡萄果实中33个葡萄茋类合酶基因Sts上调表达，在上调33个Sts基因启动子区存在脱落酸、乙烯、水杨酸和生长素等激素响应元件和MYB结合位点，对褪黑素具有不同的表达响应模式，进而提高葡萄白藜芦醇含量[43]。褪黑素和ACC增强葡萄对盐的耐受性，并且乙烯参与褪黑素诱导的耐盐性。进一步的研究表明，外源褪黑素处理和内源褪黑素的增加，通过MYB108A对ACS1基因的转录调节促进葡萄乙烯的生物合成和耐盐性提高[44]。

5 展望

褪黑素在葡萄上的应用已经开展一段时间，因为其理化性质不稳定，在组织器官确切合成位置仍不明确，植株感受褪黑素的受体及结合位点仍属未知，植物细胞中褪黑素特异受体仍是研究的重要方面。褪黑素作为一种植物激素，与其他激素的信号传导网络仍需进一步明确。关于葡萄褪黑素的研究多集中在其对生长发育的影响及其生物合成方面，较少集中在基因表达的研究层面。褪黑素与其他激素协同作用在拟南芥等模式植物上研究较多，但是葡萄基因组更为复杂，在葡萄上褪黑素与其他激素协同作用仍是未来研究的重点。