秦枫 李金贵 朱善元 王红昀 王安平 吴双

摘要：为确定ZTCI+IⅡ型天然澄清剂用于三七（Panax notoginsengj茎叶皂苷提取液除杂的最佳工艺，在单因素分析的基础上，以药物质量浓度、澄清剂用量、作用温度为自变量，以皂苷含量和固形物去除率作为评价指标，建立三因素三水平的Design-Expert响应面分析方法。结果表明，最佳除杂工艺为药液质量浓度（生药质量与皂苷提取液体积之比）为0.19 g/mL，ZTCI+IⅡ型天然澄清剂2组分加入顺序为先B组分后A组分，澄清剂B组分和A组分加入量分别为10%、5%药液体积，作用温度为40℃。在此工艺条件下进行三七茎叶皂苷提取液除杂工艺的优化，得出固形物去除率为28.40%，皂苷保留率为92.22%，其相对标准偏差（RSD）分别为1.74%和0.56%，重现性较好，验证了该模型的有效性。

关键词：三七（ Panax notoginseng）茎叶;ZTCI+IⅡ型澄清剂;皂苷含量;固形物去除率;响应面法

中图分类号：S853

文献标识码：A

文章编号：0439-8114（ 2020） 20-0150-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.034

三七（Panax notoginsengJ茎叶是植物三七的茎叶，用于镇痛止血、消肿化瘀等。其主要成分为皂苷，含有人参皂苷Rb3、C-Mxl、Rbl、Rc等几十种皂苷[1，2]。Guo等[3]从中分离到54个成分，其中，25个组分中富含皂苷。三七茎叶毒副作用小，能够治疗酒精肝[4]、肥胖症[5]、心脑血管疾病等，且能抑制芳香化酶的活性[6]。

三七茎叶虽富含多种活性成分，但是蛋白质、淀粉等杂质可干扰后期的分离，水提醇沉法较常用于去除蛋白质等杂质，但消耗乙醇量大，成本高，且费时费力，能导致有效成分的流失。絮凝澄清法通过利用澄清剂的凝聚和絮凝作用，以吸附架桥和电中和的方式除去溶液中的粗粒子，是精制和提高制剂稳定性及澄明度的一种新方法，ZTCl+IⅡ型天然澄清剂是一种较好的絮凝澄清刘[7，8]目前，虽有关于壳聚糖、明胶、ZTCI+IⅡ澄清剂等澄清三七茎叶水煎液的报道[9]，但考察因素少，试验设计简单。相较于正交设计，响应面法（ Response surface method，RSM）能设计非线性模型，创建二次回归方程，具备试验设计全面、预测精度高等優点，本研究通过响应面设计探讨优化三七茎叶皂苷提取液的澄清剂除杂工艺，为其进一步开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

日立紫外可见分光光度计U-2910，购自天美（中国）科学仪器有限公司;三七茎叶、ZTCI+I-Ⅱ型澄清剂、乙酸、高氯酸、香草醛等均购自扬州科能生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 三七茎叶皂苷提取液的制备称取三七茎叶200 9，置于烧杯中.以10倍量的去离子水加热回流提取3次，第1次2.0 h，第2、第3次各1.5 h，每次用绸布过滤热的提取液，滤过残渣，把3次提取液合并，浓缩，定容500 mL，即为三七茎叶皂苷提取液，此时的药液质量浓度为0.4 g/mL。

1.2.2 天然澄清剂的配制 组分A的配制：称取5 gA组分，用少量去离子水搅成糊状，再少量多次加去离子水使其定容至500 mL，溶胀24 h，充分搅拌均匀，用双层纱布过滤，得到1%黏胶液。

组分B的配制：称取5gB组分，加入少量1%醋酸，搅拌成糊状，以1%醋酸少量多次定容至500mL，溶胀24 h，充分搅拌均匀，以双层纱布过滤，即得1%黏胶液[10]。

1.2.3 皂苷对照品溶液的配制 将三七皂苷Rg，标准品在60℃下干燥至恒重，取2.51mg置于容量瓶中，以甲醇溶液溶解，定容至25 mL，摇匀，得对照品溶液，含量为0.100 4 mg/mL。

1.2.4标准曲线的制备按文献[11]中的香草醛一高氯酸法测定皂苷含量，制作标准曲线。

1.2.5皂苷保留率的测定取澄清前后提取液，按照“1.2.4”方法进行定量测定，皂苷保留率=澄清后皂苷的量/澄清前皂苷的量。

1.2.6固形物去除率的测定精密移取澄清前和澄清后的提取液各15 mL，放在已经干燥处理好的蒸发皿中，置于105℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干3h，之后放于37℃恒温干燥箱中冷却30 min，快速称其重量，计算其固形物的去除率（ Y1） [12]。

Y1=（澄清前固形物的量一澄清后固形物的量）/澄清前固形物的量

1.2.7 综合评分（Overall desirability，OD） 提取液中加入澄清剂进行除杂，不仅需要最大限度地减少皂苷有效成分的损失，还要保证良好的澄清效果，所以选择固形物去除率（Y1）和皂苷保留率（ Y2）一起作为评价性指标进行综合性的评分，将Y1的权重设定为0.3，Y2的权重设定为0.7，按下列公式进行计算。OD=（Y1/Y1maxx0.3+ Y2/Y2max0.7）[10].

1.3 除杂工艺单因素的考察

ZTC天然澄清剂不需要调节待处理溶液pH，主要根据溶液的性质选择不同的添加顺序，先加入的组分用量与后加入的组分用量比为2：1[13]。由于三七茎叶皂苷提取液pH=5.8，相对于蛋白质等电点pH =4.8为碱性环境，因此加入顺序为先B组分后A组分。

按单因素设计试验，分别以A、B、C、D代表药液质量浓度[生药（g）：药液（mL）]、澄清剂用量（%，以组分B占三七茎叶皂苷提取液的体积比表示）、作用温度和搅拌时间。取适量三七茎叶皂苷提取液原液，分别稀释成质量浓度为0.08、0.11、0.14、0.17、0.20 g/mL的提取液，每份20 mL，在50℃下按照2：1比例依次加入8%、4%体积比的组分B、组分A，充分搅拌20 min后放入水浴锅中50℃保温th，之后放置在室温下静置12 h，离心，过滤，定容至25 mL，测定其固形物去除率以及皂苷保留率[14]。固定4为0.17 g/mL，分别设B为4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，C为30、40、50、60、70、80℃，D为10、20、30、40、60 min，按上述方法进行试验。

1.4 响应面法优化设计

在单因素试验的基础上，根据Design-Expert设计原理，以4、B、C3个因素作為自变量，进行试验因素和水平设计，如表1所示。

2 结果与分析

2.1 标准曲线方程

建立y=0.369 5x-0.070 9，R=0.993 8的方程。y为吸光度，x表示标准品的质量浓度，表明x在0.024 26-0.121 65mg/mL，存在良好线性关系。2.2单因素试验结果与分析

A、B、C、D对澄清剂除杂效果的影响见表2至表4。由表2至表4可知，A、B、C对OD的影响较大，随着A的降低和B、C的增加，OD均呈先增大后降低的趋势。经试验测定发现，不同搅拌时间对澄清效果影响不大，对固形物去除率及皂苷保留率影响大小相差甚微，因而因素D对除杂工艺的影响可忽略。结合提取效率及工业生产的需要，拟将A设置0.14、0.17、0.20 g/mL 3个水平，B、C取最佳值为中间水平建立模型进行研究。

2.3 响应面优化试验与分析

2.3.1 模型的建立及方差分析以A、B、C为考察因素，以OD作为评价指标，按照3因素3水平的响应面分析方法进行试验，按“1.3”的方法进行，响应面分析试验设计及结果、方差分析结果分别见表5、表6。

以Design-Expert 8.0.6软件进行分析，得响应值（Y）对编码自变量的二次多项回归方程为Y=81.26 - 0.6IA+ 2.53B - 4.79C+ 0.13AB - 4.77AC -3.OIBC - 2.2IA2+ 0.4282+ 0.32C2。对该模型进行方差分析和显著性检验，由表6可知，F为8.59，概率P=0.004 9<0.01，说明模型显著;模型的确定系数R2adj为0.810 2，说明方程的因变量与全体自变量间线性关系显著，响应值的变化有81.02%来源于所选自变量;同时，模型失拟项F为1.53，概率P>0.05，可知失拟项不显著，表明该方程试验误差小，拟合情况较好。由此可得，拟合情况中的回归方程良好，因此可用回归模型代替试验真实点对试验结果进行分析。对响应值作用显著的是因素B、C、A与C、B与C，说明B、C对响应值的影响较大，A与C、B与C之间有较强的交互作用。

2.3.2 等高线与响应面结果与分析 由二次多项回归方程，分别固定因素C，取中间值50℃;固定因素B，取中间值8%;固定因素A，取中间值0.17 g/mL，可作出A与B、A与C、B与C之间的等高线和响应面，如图l所示。响应曲面的陡峭程度反映了不同试验因素对结果的影响程度，曲面越陡峭，说明该因素对试验结果影响大，反之，则对试验结果影响小。由图1（a1）可知，A与B之间作用平缓。由图l（b1）、图1（c1）可知，固定因素A，其OD均随着因素C的增高而呈先增高后降低的趋势，固定因素B，其OD均随着因素C的增高呈逐渐降低的趋势，且曲面变化非常陡峭，说明A与C、B与C之间存在强烈的交互作用，其中，因素B、因素C对结果的影响较为显著。

2.4 最佳提取工艺及验证试验

由Design-Exper 8.0.6软件进行岭脊分析，以回归模型进行预测，得出最佳工艺条件：4为0.19 g/mL，B为10%，C为40℃。为验证预测结果的真实性，在此工艺条件下进行三七茎叶除杂工艺的优化，重复3次试验，结果表明，固形物去除率平均值为28.40%，皂苷保留率平均值为92.22%，相对标准偏差（RSD）分别为1.74%和0.56%，验证了该模型的有效性。

3 讨论

3.1 回归模型建立

本研究采用由Box等[15]提出的响应面法，将数学建模和试验设计进行优化，回归拟合整体因素与结果的函数关系，取得各因素最优水平值[16]。该方法试验周期短、试验次数少、精密度高，已广泛应用于制药、农业、化工等领域[17.18]。王冬东等[19]、万丹娜等[20]采用响应面法设计优化中药黄莪凝胶、山楂的提取、除杂工艺优化等取得了较好的效果。正交试验不能获得因素和响应值之间的函数表达式，不能保证一定可获得最优方案和最优值，且水平数量较多时，试验次数多，实施较困难。本研究以三七茎叶为原料，采用澄清剂除杂工艺，在单因素试验的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件，通过响应面法优化了三七茎叶澄清剂的除杂工艺，回归分析表明该回归模型具有很高的准确性和可信度，可用于三七茎叶水提液澄清剂除杂的预测与分析。

3.2 ZTCl+1 11型天然澄清剂的除杂原理及优点

ZTCI+IⅡ型天然澄清剂由A、B两种组分组成，为天然多糖等原料中提取的天然高分子物质，采用电荷及“架桥”、再“架桥”原理起到澄清的作用。先加入的组分起主絮凝作用，使不同可溶性大分子通过“架桥”连接而使分子迅速增大;后加入的组分起辅助絮凝作用，在第一组分形成的复合物上再“架桥”，使其尽快形成沉淀。能有效去除蛋白质、鞣质、果胶、淀粉、黏液质等大分子物质，保留生物碱、皂苷类、多糖类、黄酮类等有效成分。经其处理可得理想的澄明度，对药材有效成分无质量分析上的影响。其还具有经济适用、安全性好、操作简单等特点，在天然植物提取除杂及有效成分纯化精制方面具有较高的优势[21]。

3.3 三七茎叶提取除杂工艺

近年来，相关学者通过澄清剂法、水提醇沉法等对三七茎叶的除杂工艺进行了一定的研究。潘育方等[9]应用壳聚糖对三七茎叶的煎煮液进行澄清工艺试验，得到最佳工艺为室温下以0.075 g/100 mL的比例将壳聚糖加到三七水提液中絮凝;张志信等[22]应用明胶澄清剂，以黄酮含量为检测指标，对三七茎叶水提取液进行澄清工艺研究，其最佳提取工艺为室温下以提取液体积的0.9%添加澄清剂，静置2d，调节pH为6;李维莉等[23]采用酸水提取法、膜一树脂联用技术提取并分离纯化三七叶苷，并对醇沉法、自然沉降法、无机陶瓷膜微滤法、无机陶瓷膜一树脂法、ZTC I+IⅡ型天然澄清剂法等纯化方法进行考察，结果证明，HPD 100大孔吸附树脂与无机陶瓷膜分离联用技术效果较好。上述各种方法都有纯化除杂作用，除杂率以膜一树脂法的最高，达80%以上。损失率以醇沉法最高，达30%左右。

上述研究均未通过相关正交或响应面设计等建立模型并进行试验验证，其工艺是否最佳缺乏相关依据。虽以除杂率、澄清度、有效成分含量等为检测指标，但未有综合考查指标如综合评分法等，结果判定缺乏周密性，虽然膜分离法效果较好，但滤膜抗污染能力差、寿命短，不适合工业化生产。本研究采用响应面法优化澄清剂除杂工艺，皂苷保留率大于92%，固化物的去除率大于28%，优于上述大部分研究。

综上所述，本研究建立模型得出的最佳工艺，固形物去除率和皂苷保留率较高，RSD较小，重现性较好。此模型的建立可为三七茎叶皂苷的提取精制及工业化生产提供一定的参考。

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作者简介：秦枫（1979-），女，山东烟台人，在读博士研究生，副教授，主要从事天然药物研发，（电话）13961041602（电子信箱）qinancy922@163.com;通信作者，朱善元（1967-），男，江苏泰州人，教授，博士，主要从事生物技术的研究，（电话）0523-86158001（电子信箱）jstzzsy@126.com。