徐双美，杨森，李泽娜，杨丹，陈鸿平，刘友平

(成都中医药大学 药学院，成都 611137)

1 概述

竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)为芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylum)植物。近年来，以竹叶花椒及其栽培品种为主的青花椒产业迅速发展，在四川省已经形成的川西、川中、攀西3个花椒特色优势种植区中，除了以汉源为代表的川西为红花椒集中区外，以盐边县、盐源县、金阳等为代表的攀西地区和以平昌县、通江县、渠县等为代表的川中地区都为竹叶花椒集中区，且多为地方收载品种[1]。在使用方面，竹叶花椒品种可作为药用植物、观赏植物、烹饪用途的重要来源，因此这种植物不仅用于制药，如驱虫、腹痛、牙痛、消化不良等[2-5]，也用于调味品和香料工业[6-7]。

不同产地竹叶花椒中挥发性物质的组成和含量易受气候条件(日照时间、降水量、干燥度、气温等)以及土壤特性等的影响而存在差异，因此，近年来对各品种花椒的挥发性物质也进行了一系列的研究。如Liu等[8]分析鉴定出竹叶花椒32种香味活性化合物，其中芳樟醇的气味活性值(OAV)最高，对香气贡献最大。Nirmala Phuyal等[9]发现尼泊尔竹叶花椒叶挥发性组分中含量较高的3种主要有芳樟醇、柠檬烯和十一烯-2-酮。王思思等[10]将4大产区红花椒样品分为三类，即西南地区一类，西北地区一类，华东、华北一类。袁华伟等[11]也从香辛料花椒中鉴定出主要挥发性成分芳樟醇。蒲凤琳等[12]发现药典记载的青、红花椒主要挥发性物质为芳樟醇，但青花椒中的含量高于红花椒。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

GC-MS-QP 2010 Ultra气相色谱-质谱联用仪、AOC-5000 Plus顶空进样器、Agilent 19091S-433柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm) 美国Agilent公司；AUW220D分析天平 赛多利斯科学仪器有限公司；CNW 20 mm钳口20 mL平底透明顶空样品瓶。α-Al2O3粉末为分散剂(批号：Lot.No. JF4A，日本岛津公司)。

2.2 样品收集

竹叶花椒样品见表1。

表1 竹叶花椒样品Table 1 The samples of Zanthoxylum armatum DC.

续 表

2.3 样品制备

精密称取竹叶花椒粉末(过60目筛)1.00 g，置于20 mL顶空瓶中，密封，置于静态顶空进样器中，在180 ℃下加热60 min。

2.4 气相色谱-质谱条件[13]

2.4.1 顶空条件

顶空保温平衡温度：180 ℃；顶空保温平衡时间：30 min；水平往复振荡器振荡速率：250 r/min；进样针温度：100 ℃；进样量：1.0 mL；进样针冲洗时间：2 min。

2.4.2 色谱条件

色谱柱：Agilent 19091S-433柱(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：109 ℃；载气：高纯氦气；升温程序：50 ℃开始以2 ℃/min升至120 ℃，保持35 min，以5 ℃/min升至240 ℃，保持27 min；线速度：36.5 cm/s；分流比：20∶1；进样体积：1 mL。

2.4.3 质谱条件

离子源：EI；离子源温度：230 ℃；电子能量：70 eV；电离电压：1.0 kV；接口温度：250 ℃；质量扫描范围：45～500 m/z，扫描时间：2.50～60.00 min；溶剂延时：2 min。

2.4.4 数据处理

数据采用Excel 2013及SPSS 20.0进行相似度评价以及主成分分析等处理。图形采用Origin 2015绘制。

2.5 结果与分析

2.5.1 顶空GC-MS挥发性成分检测结果

22个产地竹叶花椒样品挥发性成分的总离子流图见图1，结果见表2(按平均含量高低列出)。

图1 不同产地挥发性成分总离子流图Fig.1 The total ion flow diagram of volatile components from different places of origin

表2 不同产地挥发性成分相对含量Table 2 The relative content of volatile components from different places of origin

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2.5.2 初步统计分析

由表2可知，22个产地累计鉴别出75个成分，其中S21通江县样品鉴定出的挥发油成分数最多，有37个，其次是S14盐源县和S16三台县样品有30个，S15渠县、S17夹江县样品有27个，S11大英县、S12米易县、S13平昌县有26个，22个产地共有挥发性成分有11个，这些共有成分的总相对含量超过82%，表明这22个产地的挥发性成分相似。

选取共有成分化合物做百分比堆积柱形图(见图2)，这11种化合物在各地样品挥发性成分总量中占比达82.89%～94.69%，并且主要为烯类、醇类。

图2 四川22个产地竹叶花椒共有成分百分比堆积图Fig.2 The total composition percentage of 22 Zanthoxylum armatum DC. samples from different producing areas in Sichuan Province

由图2可知，芳樟醇、柠檬烯和侧柏烯在各个产地占的比值都比其他组分大，因此竹叶花椒的主要挥发性成分有芳樟醇、柠檬烯和侧柏烯，而S18宁南县样品的芳樟醇相对含量最高，为56.54%；S14盐源县样品的柠檬烯相对含量最高，为44.46%；S22德昌县样品的侧柏烯相对含量最高，为21.89%。可知22个不同产地样品挥发性主要成分含量差异较为明显。

2.5.3 多元统计分析2.5.3.1 主成分分析

按照KMO(Kaiser-Meyer-Olkin)和Bartlett球形度检验结果，选取22个样品全部共有成分组成11×22阶矩阵进行主成分分析。此时的KMO检验结果为0.648，非常接近0.7(Kaiser给出的一般KMO度量标准)，可以进行因子分析。将选取的数据导入SPSS 20.0中进行主成分分析，得载荷图(见图3)，2个主成分的方差贡献率分别为93.417%和4.548%，累计方差贡献率为97.965%。

图3 22个产地竹叶花椒主成分分析载荷图Fig.3 The load diagram of principal component analysis of Zanthoxylum armatum from 22 places of origin

由图3可知，采用主成分分析法可以将22个种植区样品分成两类。第一类C1有S1、S2、S3、S5、S9、S12、S13、S21，第二类C2有S4、S6、S7、S8、S10、S11、S14、S15、S16、S17、S18、S19、S20、S22。即C1有峨眉山、平昌县、泸县、南充营山县、南充仪陇县、米易、平昌县、通江县，C2有洪雅县、冕宁县、德昌县、布拖县、大英县、盐源县、达州渠县、绵阳三台县、乐山夹江县、宁南县、西昌县、金阳县、由此看出，C1类产地多集中于川中地区，C2类产地多集中于攀西地区，并且凉山彝族自治州也都集中于C2类。

2.5.3.2 相似度评价

为得到聚类分析中两个类别内各样品的相似度,使用SPSS 20.0做Pearson相关性分析，得相关系数矩阵表(见表3)。

表3 竹叶花椒挥发性成分相关系数矩阵Table 3 The correlation coefficient matrix of volatile components in Zanthoxylum armatum

由表3可知，第一类样品的相似度在0.883～0.995之间，第二类样品的相似度在0.701～0.999之间。根据各成分的标准偏差，芳樟醇、侧柏烯和柠檬烯的标准偏差最大且含量最高，所以芳樟醇、侧柏烯和柠檬烯在这两类样品中的含量差异是造成上述分类结果的主要原因。同时第二类中虽然S14盐源县和S22德昌县属于同一个州，但其芳樟醇、侧柏烯和柠檬烯的相对含量差异较大，导致它们的相似度只有0.701。

2.5.3.3 两个类别差异分析

得出22个样品表现出具有明显差异的两个类别C1和C2，分别对这两个类别进行统计对比，发现C1类样品的成分一共有37个，而C2类的有27个，C1和C2类相对含量前三的均是芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。C1类中芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯的平均总相对含量均高于C2类，由于C1类产地多集中于川中地区，C2类产地多集中于攀西地区，川中地区的挥发性组分和含量可能高于攀西地区。在非共有成分上，C1类有共同成分乙酸芳樟酯，C2类有共同成分α-松油醇，同时C2类中的凉山彝族自治州还有共同成分顺式罗勒烯、萜品醇、乙酸芳樟酯、大根香叶烯D。

2.5.4 结论与讨论

利用顶空-气相色谱-质谱联用技术检测出四川22个产地挥发性成分75个，其中共有成分11种，分别包含有醇类物质1种、烯类物质9种、烯烃物质1种，含量较高的共有成分有：芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。总相对含量超过82%，表明这22个产地的挥发性成分相似，但是主要成分含量相差较大，使得其在统计结果上呈现出有差异的两个类别，C1类产地多集中于川中地区，C2类产地多集中于攀西地区。C1类样品的成分一共有37个，而C2类的有27个，C1和C2类相对含量前三的均是芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯，其次是β-月桂烯、γ-松油烯。C1类中芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯的平均总相对含量均高于C2类，在非共有成分上，C1类有共同成分乙酸芳樟酯，C2类有共同成分α-松油醇，因此，这两个成分可能是区分不同产地竹叶花椒的关键化合物。

竹叶花椒挥发性组分的不同赋予其特有的香气特征。11种特征物中，芳樟醇具有催眠、抗抑郁、抗氧化以及抗衰老等作用，并伴有清甜的花香和木香，柠檬烯有柠檬果香，侧柏烯有杀虫剂味，β-月桂烯有清凉、中药味，萜品烯有甜味，松油醇有清香、树脂香，α-蒎烯有松木香、树脂香，α-水芹烯有柑橘香、清香、黑胡椒香，γ-松油烯有柑橘香、萜香，石竹烯有辛香、木香、柑橘香、樟脑香，α-松油醇有类似紫丁香的清香，这22个产地的共有成分均是香气活性成分。C1类芳樟醇、柠檬烯、侧柏烯、β-月桂烯相对含量较高，说明其香气偏花香和木香。有研究表明，竹叶花椒药材挥发油样品主要含有芳樟醇、柠檬烯、乙酸芳樟酯等[14]，与本文研究的主要挥发性组分基本一致。在比较不同产地挥发性成分的区别上，魏泉增等[15]发现乙酸芳樟酯和乙酸松油酯可能是区分不同产地花椒的关键化合物。