宰文静， 陈捷亮， 袁正宏

复旦大学上海医学院， 基础医学院病原生物学系， 医学分子病毒学教育部/卫健委重点实验室， 上海 200032

HBV持续感染所致慢性乙型肝炎(CHB)严重危害人类健康。每年全球约有60万人死于HBV感染相关肝硬化、肝衰竭以及原发性肝癌等疾病。目前临床上的治疗药物包括干扰素(IFN)和核苷(酸)类似物(NAs)，可有效抑制HBV转录或复制，但无法彻底清除HBV，且存在治疗响应率低或抗原阴转率低等问题，难以实现乙型肝炎治愈[1]。

HBV cccDNA作为HBV关键复制中间体及其转录复制模板，经由HBV从头感染和胞内复制回补两种途径形成，在感染肝细胞的细胞核内蓄积为cccDNA池，其持续存留是乙型肝炎慢性化和难以治愈的关键。现阶段研发的抗-HBV药物靶向HBV生命周期多个环节，包括入胞抑制剂、HBsAg抑制剂、衣壳蛋白(HBc)组装调节剂(CpAM)、HBV聚合酶(Pol)抑制剂、HBV X蛋白(hepatitis X protein，HBx)靶向药物、RNA干扰技术靶向HBV RNA等。其中入胞抑制剂和NAs等理论上可通过有效阻断肝细胞发生再感染及病毒复制从而切断cccDNA生成途径，但对于肝细胞核内既有cccDNA池，目前尚缺少针对性的有效治疗手段。

基于HBV cccDNA持续沉默是CHB“功能性治愈”的目标，深入了解cccDNA相关调控机制并寻找靶向策略是研究重点和核心任务。本文简单介绍cccDNA基本生物学特性，重点回顾目前对其转录和代谢调控机制及相关宿主因子的认知，并对cccDNA沉默清除的可能途径和靶向调控策略进行讨论。

1 HBV cccDNA生成与代谢机制及特性

HBV cccDNA经由松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)修复及回补途径形成，具体环节包括：去除与负链DNA 5′端共价结合的Pol以及5′-flap、去除正链DNA 5′端RNA引物和补齐并连接滞后链的缺口。去除与rcDNA共价结合的Pol形成去蛋白的rcDNA中间体是cccDNA形成的关键步骤，该过程可能由酪氨酸-DNA磷酸二酯酶2参与调节[2]。Flap内切酶1是一种flap结构特异性的核酸内切酶，可能参与rcDNA负链DNA 5′-flap以及正链DNA上RNA 引物的去除[3]。其他参与cccDNA形成的因子还包括Polκ、Polα等宿主DNA聚合酶、DNA连接酶Ⅰ/Ⅱ以及DNA拓补异构酶Ⅰ/Ⅱ等。近期一项体外生化系统的研究[4]提示，HBV cccDNA的形成至少需要包括人增殖细胞核抗原、复制因子C复合物、Polδ、flap内切酶1和ATP依赖性DNA连接酶Ⅰ 5个因子参与。

已有研究[5]表明，每个感染肝细胞内cccDNA拷贝数在1至几百之间不等且存在波动，平均约1.05个拷贝。cccDNA池的蓄积受限于病毒在细胞内复制和回补的效率，其受宿主和病毒因子严格控制。HBV大胞膜蛋白S缺失可促进核内cccDNA数量增加，此外，宿主固有免疫识别病毒核酸亦被报道参与cccDNA池的动态调节[6]。研究[7]表明，cccDNA伴随CHB感染的整个自然史，即使发生抗原血清转换或急性感染转归患者体内也存在少量cccDNA。抗病毒治疗理论上推测可通过阻断cccDNA新生而逐步耗竭或通过恢复免疫以间接降低cccDNA含量，但临床研究[8]表明很难彻底清除cccDNA。有数学模型推算体内NAs持续治疗下完全清除肝内cccDNA至少需15年[9]。

尽管如此，体外研究[10]表明HBV cccDNA半衰期约35～57 d；近期一项研究[11]通过测定抗病毒治疗中患者血清HBV RNA耐药突变LAMR(rtM204V)以动态反应肝内cccDNA池的更新速度，结果提示肝内cccDNA更新速率约5.6～11.1周，远快于之前估计的数十年。上述研究提示有可能通过cccDNA耗竭的方式实现cccDNA的降解清除。

2 HBV cccDNA转录调控机制及相关宿主因子

已有研究[12]表明通过与宿主组蛋白、非组蛋白及病毒结构蛋白core等结合，HBV cccDNA可进一步组装成微染色体。与EB病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒等DNA病毒episome在细胞核内易形成异染色质样状态不同，HBV cccDNA微染色体的转录往往较为活跃，存在持续病毒抗原表达和病毒复制[13]。高分辨率染色质构象捕获技术(Hi-C)研究[14]结果显示，HBV cccDNA在细胞核内主要分布于常染色质附近，且趋向于分布在富含Cfp1的CpG岛附近，从而有利于其自身转录复制。HBV cccDNA本身也包含3个CpG岛(CpG岛Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ)，其DNA甲基化状态参与调控HBV转录复制。宿主DNA甲基转移酶1/2/3可通过促进病毒DNA甲基化修饰参与cccDNA转录调控[15]。

现有研究提示，cccDNA转录受宿主因子和病毒蛋白的双重调控。研究[16]表明，HBV基因组包含多个转录因子及核受体结合位点，主要包括增强子Ⅰ、增强子Ⅱ以及核心启动子区域。肝特异性转录因子HNF1/3/4以及核受体过氧化物酶体增殖物激活受体α-维甲酸X受体α、法尼醇X受体等均可识别并调控核心启动子转录。cAMP反应元件(CRE)结合蛋白(CREB)可识别HBV增强子Ⅰ区域HBV-CRE保守序列并介导肝特异性病毒转录[17]。宿主RNA Pol Ⅱ可识别cccDNA上顺式作用元件，介导HBV基因组转录[18]。其他转录因子包括ATF、YY1、SP1、AP1、TBP等以及转录共激活因子如CRTC1、C/EBP、p300/CBP等也均被证明参与cccDNA的转录调节。

另外，cccDNA转录状态可能与其上结合组蛋白H3/H4的表观修饰状态有关。体外HBV感染细胞染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation,ChIP)-seq实验[19]结果表明，cccDNA上组蛋白大多为活化性位点修饰(H3K4me3、H3K27ac和H3K122ac)，且主要分布在启动子区域，缺少抑制性组蛋白修饰。针对CHB临床患者肝穿组织ChIP-seq研究[20]发现，cccDNA表观修饰状态存在异质性，可能与肝内病理状态及免疫抑制情况有关。表观调控因子通过调节cccDNA上组蛋白甲基化、乙酰化等修饰参与调节cccDNA转录活性，包括转录活跃(“开放”)和转录抑制(“关闭”)两种状态。本课题组前期研究[21]发现组蛋白甲基转移酶PRMT5可通过促进cccDNA上H4R3甲基化修饰(H4R3me2)表观调控cccDNA的转录活性，同时可与HBc以及Brg1依赖的hSWI/SNF染色质重塑子共同作用，抑制RNA Pol Ⅱ与cccDNA结合，从而抑制cccDNA转录。还有研究[22]表明组蛋白去乙酰化酶SIRT3通过与SUV39H1共同作用抑制SETD1A募集从而促进H3K9甲基化修饰(H3K9me3)并降低H3K4甲基化水平(H3K4me3)，由此减少cccDNA上RNA Pol Ⅱ和转录因子YY1结合并限制cccDNA转录。其他宿主因子包括HDAC1、EZH2、PRMT1、SIRT1、SETDB1、PCAF/GCN5等也被报道参与HBV cccDNA表观及转录调控。

3 HBV cccDNA沉默途径及策略

3.1 宿主限制因子 研究表明，病毒感染过程中病毒与宿主之间存在多种相互作用，与病毒的维持复制和致病密切相关，同时宿主细胞内也存在多种拮抗机制抑制病毒转录或复制，相关的宿主蛋白称为“限制因子”(antiviral restriction factor, ARF)。ARF作为固有免疫系统的一部分，在多种病毒领域被广泛研究。其主要的特征包括：(1)具有抗病毒功能效应；(2)通常由IFN或病毒感染所诱生；(3)可被病毒蛋白拮抗；(4)具有基因突变率高(“positive selection”)的遗传学特征；(5)无病毒感染时其细胞内表达水平受严格调控；(6)某些情况下其在细胞内持续表达。部分ARF特异性针对特定类型的病毒，部分则具有广谱的抗病毒效应[23]。目前已有多种针对HBV的宿主限制因子被鉴定，包括SMC5/6、Mx2、APOBEC3C、TRIM22、ZAP、SAMHD1、Myd88等，但直接针对cccDNA的较少。IFN诱生基因Mx2可以通过抑制HBV RNA转录以及病毒复制发挥抗HBV效应，其也可通过抑制回补的方式降低感染肝细胞内cccDNA的含量[24]。锌指蛋白ZAP可识别HBV前基因组RNA末端冗余序列(nt 1820-1918)并促进HBV RNA转录后降解[25]。其他一些转录因子和表观调控因子如NF-κB、STAT1/2、PROX1、SETDB1、ZHX2、DDX3等也被发现作为HBV宿主限制因子，可直接或间接导致HBV转录抑制或沉默。进一步筛选、鉴定HBV cccDNA特异性宿主限制因子可能为开发新型抗-HBV药物提供新的靶点及策略。

3.2 表观沉默 鉴于cccDNA转录活性受表观因子调控，通过表观调控可能使转录活跃的cccDNA转变为非活动转录状态，从而实现CHB功能性治愈。IFN可通过改变cccDNA的表观修饰状态发挥对cccDNA转录复制的抑制，而对cccDNA直接清除降解的效应较弱。研究[26-27]表明，IFNα对HBV转录复制的抑制与其减少STAT1和STAT2复合物在cccDNA上结合、以及减少cccDNA微染色体上活化性组蛋白乙酰化修饰(H3K9ac、H3K27ac)有关；此外，IFNα还可通过招募其他转录调节因子包括转录抑制复合物PRC2(YY1和EZH2)、HDAC1和hSirt1等因子与cccDNA结合，从而表观抑制cccDNA转录。其他细胞因子如IL-6、IL-1β等也被报道具有类似效应。IL-6可以使cccDNA上组蛋白乙酰化减少及转录因子HNF1α、HNF4α结合减少，并促使STAT3从cccDNA重新分布至宿主靶基因，从而表观沉默cccDNA[28]。利用现有的表观调节剂可能有利于HBV cccDNA直接靶向沉默治疗，从而减轻HBV感染所致肝脏病理损害或可部分恢复宿主免疫。例如，HDAC1抑制剂被证明可以通过直接靶向cccDNA转录所需宿主因子包括HDACs抑制鸭HBV cccDNA转录，但该效应在不同的细胞模型中尚存在争议[27]。然而已鉴定的cccDNA表观调控因子往往对宿主基因也具有广泛调控作用，如何筛选、鉴定HBV cccDNA特异性的表观调控靶点仍有待解决。此外需关注，表观调控的手段仅能实现cccDNA的转录沉默而不能降解清除cccDNA，特定情况下如抗肿瘤药物或免疫抑制剂治疗期间可能会导致HBV的再激活[29]。

3.3 靶向病毒蛋白HBx和HBc 已知，病毒蛋白HBx和HBc在参与cccDNA微染色体结构组装、转录表观调控以及细胞内稳定维持等方面均发挥重要作用，其中HBx可以通过与多种宿主因子直接作用并招募其结合至cccDNA微染色体上，从而有利于病毒自身的转录复制。例如，HBx作为cccDNA转录共激活因子，可促进CREB二聚化及转录共激活因子CRTC1、p300/CBP等募集激活cccDNA转录[30]。HBx也可通过招募p300/CBP、PCAF/GCN5抑制HDAC1、SIRT1等表观因子与cccDNA结合并促进cccDNA上H3/H4乙酰化修饰，正向调控cccDNA转录活性[31]。此外，HBx可通过多种途径拮抗宿主限制因子。例如，SMC5/6可以与HBV cccDNA结合并抑制cccDNA转录，HBx被证明可以通过劫持宿主CRL4 E3连接酶系统促进SMC5/6经蛋白酶体途径降解，从而有利于cccDNA转录[32]。通过药物靶向HBx，可能有利于降低cccDNA转录活性或使其表观沉默，同时解除HBx对宿主限制因子的降解作用，促进cccDNA的沉默或清除。广谱性抗感染药物硝唑尼特(NTZ)被报道可阻断HBx-DDB1复合物形成。进一步通过高通量药物筛选、设计抗体等方式寻找靶向HBx的药物可能有助于实现乙型肝炎功能性治愈。病毒核心蛋白HBc/core与cccDNA直接结合，使微染色体结构更致密，其核小体间距较宿主染色体缩短10%，可能与cccDNA稳定维持相关。HBc可通过与cccDNA上富含CpG区域结合促进cccDNA转录。研究[33]表明，HBc可介导APOBEC3A/B结合至cccDNA并导致cccDNA脱氨基及降解。CpAM可阻止核衣壳的组装或促进结构异常的核衣壳装配，可有效抑制HBV DNA水平并阻止rcDNA形成cccDNA；同时可能导致既有cccDNA结构功能异常或抑制其转录[34]。当前已有部分CpAM类药物正在进行二期临床评价，其与NAs联合使用是否具有协同抗病毒效应有待进一步观察研究。

4 HBV cccDNA清除途径及策略

4.1 非杀细胞清除cccDNA 研究[35]表明，急性乙型肝炎感染转归的过程中，存在非杀细胞清除cccDNA的现象。在HBV转基因小鼠中输入HBsAg特异性CD8+杀伤性T淋巴细胞(CTL)可以显著降低肝细胞内HBV转录及复制，同时HBcAg阳性细胞的比例由75%降低至约为0，而发生肝损伤的程度显著低于清除所有感染细胞所需杀伤的肝细胞数，提示CTL可能通过非杀细胞的方式促进HBV RNA及DNA的清除。对HBV急性感染黑猩猩中HBV清除与肝损伤的动态观察[36]结果显示，黑猩猩肝内HBV DNA及cccDNA的急性清除发生在CTL浸润之后、肝损伤发生之前，提示CTL分泌的细胞因子及其下游的调节因子可能介导了cccDNA的降解或清除。IFNγ、TNFα作为CTL分泌的细胞因子，已被证实可以通过非杀细胞的方式促进小鼠模型中HBV DNA以及cccDNA的清除[37]。采用IFNγ及TNFα单克隆抗体处理HBV转基因小鼠可以阻断输入的HBsAg特异性CTL对HBV RNA和HBV DNA的非杀细胞清除效应[38]。APOBEC家族蛋白作为IFN诱生基因，被报道可能是非杀细胞清除cccDNA中的关键介导因子[39]。高剂量IFNα或LTβR激动剂诱生的APOBEC3A/3B(A3A/A3B)可以与病毒蛋白core相互作用并被募集至cccDNA上，通过诱导cccDNA负链脱氨基作用促进cccDNA的降解，但仍存在争议。可以说介导非杀细胞清除cccDNA的关键通路和效应因子仍不明确，如何研究并揭示相关机制并用于HBV cccDNA靶向清除是亟需解决的问题。

4.2 杀细胞清除感染肝细胞 除了非杀细胞清除cccDNA之外，免疫介导的对感染肝细胞的杀伤是cccDNA清除的另一关键途径。研究[40]表明，急性感染恢复时期，CTL是介导HBV清除的主要效应细胞。然而在CHB患者体内往往存在T淋巴细胞功能紊乱或功能性耗竭。HBV特异性免疫功能紊乱是乙型肝炎慢性化的主要原因之一，可能与抑制性的细胞因子如IL-10分泌、免疫检查点PD-1/PD-L1表达上调以及外周长期病毒抗原刺激导致T淋巴细胞疲劳或功能紊乱有关[41]。开发调节HBV特异性细胞免疫反应的治疗方法有利于免疫控制HBV感染，从而实现乙型肝炎“功能性治愈”。现有的免疫调节手段包括应用模式识别受体激动剂如TLRs激动剂和RIG-Ⅰ激动剂、阻断免疫检查点的抗体如使用抗PD-1/PD-L1从而恢复HBV特异性CTL功能、研发治疗性疫苗(HBsAg/PreS、HBcAg等蛋白疫苗、DNA疫苗以及病毒载体疫苗等)、采用基因编辑技术制备HBV特异性CAR-T或TCR-T细胞并回输至患者体内等[42]。此外，通过抗病毒药物或特异性抗体降低患者体内HBV抗原表达也有利于部分缓解T淋巴细胞功能耗竭的情况。通过免疫调节恢复T淋巴细胞功能可能实现乙型肝炎治愈，存在的风险是可能导致严重的肝损伤甚至急性肝衰竭。

4.3 肝细胞自我更新、cccDNA分裂丢失 HBV cccDNA尽管在非分裂肝细胞中非常稳定，但在肝细胞分裂过程中其含量会快速降低[43]，其可能机制包括：(1)cccDNA不能通过滚环复制的方式随宿主染色质复制；(2)与EB病毒、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、人乳头瘤病毒等DNA病毒可通过编码蛋白将病毒episome锚定在宿主染色质上[44]不同，cccDNA无类似功能病毒蛋白，因而导致其在细胞分裂过程中易被丢失或稀释。HBV急性感染恢复时期存在肝脏自我修复、肝细胞分裂更新，研究[45-46]证实该过程伴随着cccDNA含量的显著降低。在CHB治疗过程中需注意的是，为保证肝细胞分裂过程中新生的肝细胞不被HBV再次感染和进行HBV复制，采用HBV入胞抑制剂或NAs可能是一种策略[47]。

4.4 基因编辑工具靶向HBV cccDNA 基因编辑工具包括ZFNs、TALENs以及CRISPR/Cas9等均被证明可以靶向编辑HBV cccDNA。通过诱导插入或缺失突变导致HBV蛋白表达异常、从而影响病毒复制，其也可以通过诱导部分cccDNA的降解实现HBV cccDNA的清除[48-49]。但其应用于临床治疗仍然存在很大的安全和技术问题，包括如何避免脱靶效应以及如何将基因编辑工具靶向递送至感染肝细胞。此外，通过基因编辑工具使HBV cccDNA线性化后可能会导致HBV整合的概率增加；切割后的cccDNA往往会被宿主DNA修复机制修复后重新环化，由此可能会导致HBV cccDNA突变和耐药[50]。

5 展望

近年来，新的高通量测序及筛选技术手段不断涌现，可能为乙型肝炎治愈相关研究和实现精准化治疗提供了新的技术手段和策略。全基因组筛选包括siRNA文库、shRNA文库以及CRISPR/Cas9文库筛选技术作为高通量鉴定特定功能蛋白的有效工具，可用于HBV cccDNA靶向沉默或降解清除的宿主因子筛选。单细胞测序、定量蛋白质组学研究病毒蛋白、核酸与宿主细胞之间相互作用关系，可能有利于揭示病毒感染建立关键介导因子及病毒与宿主细胞相互拮抗机制，为抗病毒治疗提供新的靶点。其他技术手段包括多组学联合分析临床标本队列、以及结合传统的“Pull-down”、ChIP及蛋白质谱或基因测序技术鉴定特定蛋白-蛋白/DNA/RNA相互作用，可有利于寻找cccDNA特异性结合或转录调控因子。体外生化系统的建立也有助于加深对cccDNA生物学特性的了解及相关宿主因子鉴定。高通量化合物筛选靶向病毒蛋白HBx、HBc或直接靶向cccDNA的分子可为抗病毒治疗提供新的候选药物及治疗靶点。针对不同筛选策略构建相应的细胞模型是能否筛选成功的关键，例如可能需要相应的带有报告基因的重组cccDNA细胞模型；对HBV感染建立过程中病毒与宿主蛋白相互作用的研究，需要利用可支持HBV长期、高效、稳定感染的细胞模型如5C-PHH细胞模型；鉴定与cccDNA特异性结合或靶向调控的宿主因子，尝试体外重构并标记cccDNA可能是较为合适的手段。总之，随着对cccDNA生物学特性及转录和代谢调控机制认识的逐步加深，将为研发沉默清除cccDNA的新型抗病毒治疗策略提供坚实的基础，以期最终实现乙型肝炎治愈。