张雅敏 孙欢 倪培艳 李涛

精神分裂症遗传度约79%[1]，是多基因多因素的复杂疾病，Erb-B2受体酪氨酸激酶4（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 4，ERBB4）基因是精神分裂症的易感基因之一[2]。小清蛋白（parvalbumin，PV）中间神经元是一类表达PV的中间神经元。既往研究显示，PV中间神经元Erbb4基因条件性敲除（PV-Erbb4-/-）小鼠树突脊密度和兴奋性突触数量改变[3]，可作为精神分裂症的小鼠模型[4]。大脑信息加工过载是精神分裂症的主要特征，感觉运动门控受损是导致该异常的重要机制之一[5]。小鼠模型中可以通过前脉冲抑制 （prepulse inhibition，PPI）实验检测感觉运动门控功能[6]。既往健康人群[7]和正常小鼠[8]的研究均发现听觉刺激的PPI随着年龄增加有所降低。而精神分裂症模型（PVErbb4-/-）小鼠PPI的研究目前多集中于刚成年小鼠（6～10周）[3-4]，因此其 PPI随年龄的变化尚不清楚。精神分裂症模型小鼠和正常小鼠PPI随年龄变化的差异可以反映精神分裂症病程对小鼠PPI的影响，进而反映疾病对机体可能造成的长期影响，因此PPI随年龄的变化是精神分裂症基础研究和临床诊疗中值得关注的问题。本研究假设精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠的PPI也会随年龄变化，在小鼠青年、中年和老年三个年龄阶段进行PPI实验，为进一步研究精神分裂症可能的发病机制提供基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象本实验所用精神分裂症模型为精神分裂症风险基因Erbb4在PV阳性的γ-氨基丁 酸 （gamma-aminobutyric acid，GABA）能 神 经元中条件性敲除（PV-Erbb4-/-）小鼠，由中国科学院神经科学研究所熊志奇教授赠送的PVErbb4+/-杂合子小鼠交配所得[9]。实验共计使用45只精神分裂症模型小鼠（PV-Erbb4-/-）和 51只正常对照小鼠（PV-Erbb4+/+）。小鼠于四川大学华西医院科技园实验动物房饲养繁殖，动物房恒温24℃，独立通气系统，采用12 h昼夜节律（光照时间 7:00-19:00）。小鼠 5只/笼，可自由摄食和饮水。所有动物实验按照国家医学研究会制定的动物实验守则中饲养和使用实验动物指南进行，实验操作符合四川大学华西医院动物管理委员会要求。

由于小鼠的性成熟时间为 8～12周[10]，15月时生殖腺开始衰老，并持续到18月[10]。本实验选取性发育完全成熟的3～6月龄小鼠为青年组，15～18月龄小鼠为中年组，19～22月龄段小鼠为老年组。

1.2 方法

1.2.1 基因型鉴定 在小鼠出生后3周剪取其尾巴2～3 mm，采用酸碱法提取尾巴组织中DNA，以鉴定Erbb4基因型。通过聚合酶链式反应对Loxp和Cre片段进行扩增，将产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型。Loxp扩增引物为5′-AAACATC CTCTTGTGTGCTTTTGTAC （正向） 和 5′-CTCG GTACTGCTGTTCCAGGTCAGA（反向），Cre扩增引物为 5′-TTCGCAAGAACCTGATGGAC（正向）和 5′-CATTGCTGTCACTTGGTCGT（反向）。

1.2.2 PPI实验 同时用4个经过校准的箱式前脉冲抑制测试仪进行测试。每个测试箱内有一个可以放置小鼠的透明有机玻璃方盒，与测试动物反应的动力传感器连接。测试箱隔音避光，顶部内置扬声器，用以产生背景声音和不同声强的声音刺激，实验时尽量保持环境安静。通过扬声器给予声音刺激，包括震惊刺激（120 dB）和较弱的前脉冲刺激（74 dB、78 dB或86 dB），小鼠对这些突然的听觉刺激会做出全身肌肉屈曲伸直的反射，在行为上表现为惊跳，用动力传感器记录惊跳的反应幅度。

PPI实验程序包括适应期、Block 1～3等4个阶段，以及3种不同强度的前脉冲刺激模式。适应期小鼠在背景噪声为62 dB的测试箱中适应5 min以减小背景噪音对结果的干扰。Block 1阶段为120 dB的震惊刺激，共10次。Block 2阶段包括6种模式：①仅62 dB背景噪声；②仅120 dB震惊刺激；③仅74 dB、78 dB或86 dB的前脉冲刺激；④～⑥74 dB、78 dB、86 dB前脉冲刺激及间隔100 ms的120 dB震惊刺激。共40次震惊刺激，用于检测小鼠的PPI强度。6种模式以伪随机的形式出现，以保证只有前脉冲的模式（模式③）每6次出现1次，相邻模式之间间隔10～20 s。Block 3阶段同Block 1，用于与Block 1对比分析小鼠是否在实验中产生适应性。采集惊跳的反应幅度数据后，采用SOF-826 Pre-Pulse Inhibition Startle Pro软件（Med-Associates公司，圣地亚哥，美国）进行处理和分析。用前脉冲抑制效率（PPI%）表示PPI的强度，PPI%=（震惊刺激的反应幅度－前脉冲联合震惊刺激的反应幅度）÷震惊刺激的反应幅度×100%，其中震惊刺激的反应幅度为Block1中仅在震惊刺激条件下所诱发的反应幅度均值，前脉冲联合震惊刺激的反应幅度为Block2中某一强度前脉冲刺激强度联合震惊刺激条件下所诱发的反应幅度均值。

1.3 统计学方法采用R3.3.2进行统计分析。PPI%满足正态分布，采用±s描述。用配对t检验比较Block 3与Block 1的PPI%，分析小鼠的适应性。用独立样本t检验比较两种基因型小鼠的PPI%。用线性回归模型分析年龄分组与Erbb4基因型对PPI%影响的交互作用，同时将性别作为协变量。若存在交互作用，分别在两个基因型分组内构建线性回归模型以分析年龄对PPI%的影响。检验水准α=0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 一般资料共有50只青年小鼠、23只中年小鼠和23只老年小鼠完成PPI测验，三组平均月龄分别为（4.16±0.75）月、（16.27±0.43）月、（20.09±1.55）月。各个月龄阶段中，不同基因型小鼠月龄和性别构成比组间差异均无统计学意义 （P＞0.05）。见表 1。

2.2 PPI实验结果小鼠Block 3与Block 1的PPI%差异无统计学意义（t=0.52，P=0.12）。

在前脉冲刺激为74 dB时，青年组正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠PPI%比精神分裂症模型（PVErbb4-/-）小鼠高（t=2.30，P=0.03），见表 1。 回归模型中，Erbb4基因型与年龄分组的交互项无统计学意义 （PV-Erbb4-/-中年组：β=-3.38，P=0.74；PV-Erbb4-/-老年组：β=19.86，P=0.06）， 年龄主效应有统计学意义（β=-13.43，P=0.03），见图 1。

在前脉冲刺激为78 dB时，青年组正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠PPI%比精神分裂症模型（PVErbb4-/-）小鼠高（t=2.74，P＜0.01），而老年组相反（t=-2.28，P=0.03），见表 1。 回归模型中，Erbb4 基因型与年龄分组的交互项有统计学意义 （PVErbb4-/-中年组：β=5.28，P=0.60；PV-Erbb4-/-老年组：β=25.84，P=0.01），见图 1。 在不同基因型组内分析，正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠中，以青年组作为参照，老年组的 PPI%更低（β=-13.61，P=0.02）。在前脉冲刺激为86 dB时，老年组精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠比正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠高（t=-2.80，P=0.01），表 1。 回归模型中，Erbb4基因型与年龄分组的交互项有统计学意义 （PVErbb4-/-中年组：β=7.13，P=0.39；PV-Erbb4-/-老年组：β=22.46，P＜0.01），见图 1。 在不同基因型组内分析，正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠中，以青年组作为参照，老年组的 PPI%更低（β=-10.58，P=0.03）。

图1 基因型和年龄分组的交互作用 图中74 dB、78 dB和86 dB为前脉冲刺激的强度；PV-Erbb4-/-为精神分裂症模型小鼠，PV-Erbb4+/+为正常对照小鼠；PPI%=（震惊刺激的反应幅度－前脉冲联合震惊刺激的反应幅度）÷震惊刺激的反应幅度×100%。

表1 各月龄阶段精神分裂模型小鼠与对照小鼠月龄、性别和PPI%

3 讨论

感觉运动门控损伤在精神分裂症患者中普遍存在，PPI实验是精神分裂症动物模型中检测感觉门控功能的常用手段。既往PPI研究多集中于刚刚成年的小鼠（6～10周），本研究纳入3～6月青年组、15～18月中年组、19～22月老年组的精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠和正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠，以研究年龄对PPI的影响。研究发现，青年组精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠比正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠的PPI%更低，年龄分组和基因型对PPI%的影响存在交互作用，正常对照组（PV-Erbb4+/+）小鼠中PPI%随年龄增长降低，而精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠中PPI%随年龄变化的方向相反。

各组小鼠Block 3与Block 1的PPI%无统计学差异，说明本研究模型小鼠没有适应性，结果较为可靠[11]。青年组精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠的PPI%均低于正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠，结果与精神分裂症存在感觉运动门控损伤一致。最新研究显示，孕期母体的免疫激活会导致后代大鼠神经炎症水平增高和PPI异常，提示神经炎症可能是PPI的生物基础[12]。但是本研究在老年组中，精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠的PPI%更高。既往研究没有关于不同Erbb4基因型老年小鼠PPI的报道。本研究进一步分析发现，上述结果是由于不同基因型小鼠PPI随年龄变化的方向相反导致的。

本研究首次发现年龄分组和Erbb4基因型对PPI的影响存在交互作用，正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠PPI%随着年龄增加而降低，而精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠相反。既往研究显示正常小鼠PPI随月龄增加而减小[8，13]。但人类研究结果与动物研究结果不太一致，有研究报道PPI在正常人群中随着年龄的增长呈倒U形曲线变化[14]，也有研究显示年龄对PPI没有影响[15]。抑制理论认为，当外界给予机体刺激时，大脑会自动兴奋，而部分刺激与当前的行为目标不相关，只有抑制不相关刺激引起的自动兴奋，机体才能更有效地分配注意力以完成当前目标。在PPI实验中，听觉刺激是干扰信息，其引起的惊跳占用了小鼠的注意力而不能完成其他有意义的任务，抑制干扰信息的能力对于小鼠的正常功能有重要意义[16]。既往研究显示，这种抑制干扰信息的能力随年龄增长而衰退[17]。PPI下降说明机体对不相关信息的抑制能力降低，因此PPI随年龄下降与抑制功能随着年龄增长而衰退的研究结论相一致。从中年到老年，正常小鼠PPI下降，而在正常人中却上升，提示遗传背景可能是PPI随年龄变化的主要影响因素。精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠和正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠也存在PPI随年龄增加而变化方向相反的现象。这些结果提示不同的机体功能可能会随着年龄增长呈现不同改变，这些过程可能还受到诸多因素的影响，有待更多研究进一步阐明。

此外，本研究的三种前脉冲刺激模式下，78 dB时基因型与年龄分组有交互作用，不同基因型小鼠的差异明显，且正常小鼠PPI随年龄变化更明显。因此，78 dB这个前脉冲刺激可能更有效地评估精神分裂症模型（PV-Erbb4-/-）小鼠的感觉运动门控损伤，对于年龄的影响也更敏感。最后，本研究的不足之处是老年组样本量相对较小，可能导致该组结果统计效能不足，相应结论需要更大样本量进行验证。

综上，本研究结果提示精神分裂症模型（PVErbb4-/-）小鼠表现出显著的感觉运动门控功能缺陷，其PPI强度随年龄变化的方向与正常对照（PV-Erbb4+/+）小鼠相反。前脉冲刺激为78 dB时，可能可以更有效地评估精神分裂症模型 （PVErbb4-/-）小鼠的感觉运动门控功能损伤，对于年龄的影响也更敏感。