李浩然，丁 峰,,3 ，张树伟，彭宏祥，潘介春，何新华,3，王 颖，李 琳，王金英，黄 幸，谭春露，徐炯志

（1. 广西壮族自治区农业科学院/广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007；2. 广西大学农学院，广西 南宁 530004；3. 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广西 南宁 530004；4. 广西壮族自治区农业科学院园艺研究所，广西 南宁 530007）

0 引言

【研究意义】龙眼（Dimocarpus LonganLour.）是我国南方特色果树，俗称桂圆[1]。龙眼肉营养价值高，富含维生素和磷质，不仅对人体有养血安神等保健作用，而且能增强机体免疫力[2]，被人们推崇为“果中圣品”，是具有重要经济和药用价值的名优特色果树。但因品种结构不合理导致的产期过于集中、综合性状不良等问题使我国龙眼产业在国际竞争中处于劣势[3]。为了有效调节龙眼产期，提高龙眼生产效益，有关龙眼成花机理、产期调节技术、龙眼成花的分子生物学研究逐步成为研究热点。【前人研究进展】植物转录因子MYB 是近年来发现的一类转录因子，与调控植物生长发育、生理代谢、细胞的形态和模式建成等生理过程有关，在植物中普遍存在，是植物中最大的转录组家族之一[4]。大多数MYB 蛋白在N 端含有一段特定的氨基酸残基组成的MYB 结构域，根据这个高度保守的结构域特征可将MYB 转录因子分为4 个亚类：1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB（4 个R1/R2 的 重复）。MYB-related（1R-MYB）类基因家族只含一个R 结构域，单一R 结构的MYB 蛋白是重要的端粒结合蛋白，可存在于肽链的两端或中间，其主要作用是维持染色体结构的完整性，在调节基因转录过程中发挥一定的作用[4]。MYB-related 基因家族分为5 个高度保守的亚家族，包括CCA1-like/R-R、TBPlike、CPC-like、I-box-like 和TRF-like，结 构 非 常 保守。TRF-like 亚家族数量非常少，在进化过程中非常保守[5]。已有研究表明MYB 类转录因子能够响应干旱、低温胁迫等环境因子，如：羊草LcMYB2在植物干旱胁迫反应中起至关重要的作用[6]；水稻OsMYBR1的表达受干旱和寒冷诱导[7]。研究还发现干旱[8]、低温[9]等胁迫会影响植物的开花。说明MYB 类转录因子在胁迫因子促进植物开花过程中可能起重要作用。目前已有大量Myb-related 基因从植物中分离出来，但只有少数基因的功能为人所知，在玉米中，3 种Myb-related 基因（Cl、Pl 和P）是黄酮类化合物和衍生色素形成所必需的[10−11]，Nguyen Hoai Nguyen[12]等发现RVE8 可以直接与花青素生物合成中所涉及的启动子基因相关联，并在响应昼夜变化过程中调控这些基因的表达，RVE 被认为是植物中花青素生物合成的昼夜节律调节因子，而且花瓣和果实的颜色可吸引动物进行授粉和种子传播，对植物成花及结果有重要作用。可见Myb-related 基因的存在群体很广泛，且与植物色素合成、开花等功能联系紧密。【本研究切入点】在龙眼成花过程中，低温、干旱起关键作用，能够促进龙眼开花，MYB 类转录因子此过程中也可能起关键作用。但目前关于1R-MYB（MYB-related）类亚家族基因参与调控龙眼成花方面的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究基于转录组测序结果，以期克隆获得龙眼MYB14基因全长序列，并开展生物信息学分析，构建超表达载体pBI121-MYB14，为今后研究该基因的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为四季蜜龙眼叶片，样品采自广西大学农学院标本园实验基地，取样树体要求长势良好，由于新叶不具有代表性，故尽可能选取老熟叶片，采摘后迅速用纸巾擦拭叶片灰尘清洗干净，按照每份10 张叶片包装并使用液氮速冻，随后放入-80 ℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 龙眼叶片总RNA 提取和cDNA 合成 取约100 g 龙眼叶片样品加液氮研磨，采用RNA 提取试剂盒提取龙眼叶片总RNA，用紫外分光光度计检测RNA 纯度和浓度，cDNA 的合成采用cDNA 逆转录试剂盒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 龙眼MYB14基因的克隆与测序 首先利用Primer Premier 5.0 软件设计PCR 引物MYB14 F、MYB14 R1、MYB14 R2（表1）。以上述cDNA 稀释2～3 倍后的产物为模板，MYB14 F、MYB14 R1 为引物，Prime STAR MAX premix（2×）（高保真酶）扩增第一次，再以第一次扩增产物为模板，MYB14 F、MYB14 R2 为引物，ExTaq酶扩增第二次。随后，用胶回收试剂盒回收与目的基因大小条带相符的基因片段，得到比较纯的目的基因，经1%的琼脂糖凝胶电泳检测确认回收基因条带准确性。将MYB14基因回收产物PCR 产物连接到pMD18-T 载体上，稀释一倍后转化DH5α 感受态细胞，摇床培养后涂于已添加氨苄抗生素（Ampicillin）（100 mg·L−1）的LB 固体培养基37 ℃培养15～18 h，随机挑选阳性克隆菌并扩繁菌液，使用通用引物MF47 和MR48（表1）进行菌落PCR 检测阳性克隆，最后将菌液送生物公司测序。

表 1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.2.3 龙眼MYB14生物信息学分析 NCBI ORFfinder 在线分析龙眼MYB14的开放阅读框；ExPASy ProtParam tool 在线工具分析龙眼MYB14的理化性质；NCBI-CDS 在线软件预测蛋白保守结构域；NCBI-BLAST 工具与其他物种氨基酸序列进行比对分析；SignalP 4.1 Server 在线工具对龙眼MYB14 蛋白进行信号肽分析；在线软件TMHMM Server.2.0预测龙眼MYB14 蛋白的跨膜螺旋区；植物亚细胞定位预测在线分析工具PSORT II Prediction 进行亚细胞定位分析；在线预测工具NetPhos3.1 Server 分析蛋白的磷酸化位点；在线分析工具SOPMA 对蛋白进行二级结构预测；Phyre2 在线工具预测蛋白三级结构[13]；采用MEGA5.0 邻近相接法（Neighbour joining）步长值1 000 构建系统进化树；DNAMAN V6 软件进行同源基因的多重序列比对。

1.2.4 龙眼MYB14基因超表达载体构建 通过infusion试剂盒提供的引物设计网站设计含有XbaI 和SmaI 酶切位点的引物，暂命名为CBD MYB14-F、CBD MYB14-R（表1），通过PCR 扩增获得加入XbaI 和SmaI 酶切位点的MYB14基因目的片段，胶回收目的基因MYB14。采用XbaI 和SmaI 双酶切表达载体质粒pBI121，采用5X In-Fusion HD Enzyme Premix 将目的基因MYB14连接入双酶切质粒PBI121 中，随后将连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞DH5α[13]，吸取150 μL 菌液涂于已添加卡那霉素（Kanamycin）（100 mg·L−1）的LB 固体培养基，培养24～36 h 后随机挑选阳性克隆菌再度扩繁，对其菌液进行PCR 验证，构建的表达载体别命名为PBI121-MYB14。

2 结果与分析

2.1 龙眼MYB14基因ORF 的克隆

以四季蜜龙眼叶片cDNA 为模板，并使用设计的全长引物扩增出PCR 产物，经琼脂糖凝胶电泳检测并获得900 bp 左右的片段（图1-a），将回收目的基因片段与pMD18-T 载体连接，通过菌液PCR 检测后得到900 bp 左右的目的基因片段（图1-b）[13]。阳性克隆菌测序结果显示，该基因ORF 全长831 bp，编码276 个氨基酸（图2）。

注：M：Maker DL2000；1：目的条带。a：cDNA 为模板的MYB14PCR 扩增产物。b：pMD18-T MYB14 质粒为模板的菌液PCR 电泳结果。Note: M: Maker DL2000; 1: target band. a: PCR amplification products ofMYB14using cDNA as template. b: electrophoresis of microbial PCR using pMD18-T MYB14 plasmid as template.

图 2 MYB14基因ORF 序列及编码蛋白质Fig. 2 ORF sequence and encoding protein ofMYB14

2.2 龙眼MYB14生物信息学分析

2.2.1 龙眼MYB14编码蛋白质理化性质预测及分析 预测和分析龙眼MYB14编码的蛋白质理化性质，结果显示，该蛋白质分子式为C1325H2138N392O422S7，原子总数为4 284，相对分子量为30 536.34 Da；由276 个氨基酸组成，带正电荷（Arg+Lys）氨基酸残基总数为41，带负电荷（Asp+Glu）氨基酸残基总数为37。理论等电点pI 为8.86，脂肪指数71.2，总平均亲水性预测为−0.700，属于亲水蛋白，不稳定指数为52.27，属于不稳定蛋白[14]。

2.2.2 龙眼MYB14 蛋白保守结构域预测与分析 对龙眼MYB14 蛋白保守结构域预测分析表明，该蛋白和SANT-TRF 超家族有联系，其功能区域与端粒结合因子有关，属于SANT-TRF/ Myb-related 超家族，在多肽链的N 端存在 Myb-related 结合位点（图3），且存在SANT/Myb-related 家族的端粒重复结合因子样DNA 结合域，TRF 型蛋白的单个Myb-like 结构域与酵母RAP1 中发现的串联Myb-like 结构域相似。通过NCBI-BLAST 工具与其他物种氨基酸序列进行比对分析，与其他物种Myb-related 组蛋白序列相似，可判定为Myb-related 蛋白。

图 3 NCBI 中龙眼MYB14 氨基酸序列保守结构域Fig. 3 Conserved domain in longanMYB14amino acid sequence by NCBI

2.2.3 龙眼MYB14 蛋白质信号肽、跨膜结构及亚细胞定位的预测 对龙眼MYB14 蛋白进行信号肽分析，发现该蛋白属于非分泌型蛋白。利用软件TMHMM-2.0 对龙眼MYB14 蛋白的跨膜螺旋区进行预测，结果未发现跨膜螺旋区，表明该蛋白属于非跨膜蛋白。使用PSORT II Prediction 对龙眼MYB14 进行亚细胞定位预测分析，结果显示该蛋白89%的概率在细胞质中，推测龙眼MYB14 转录因子定位于细胞质[14]。

2.2.4 龙眼MYB14 蛋白质磷酸化位点预测 分析龙眼MYB14 蛋白的磷酸化位点，发现该蛋白由57 个苏氨酸（Threonine）氨基酸磷酸化位点（阈值＞0.5）构成，推测龙眼MYB14 蛋白活性的调控可能与磷酸化作用有关，即龙眼MYB14 蛋白发生磷酸化修饰时苏氨酸可能起重要作用（图4）[14]。

图 4 龙眼MYB14 蛋白磷酸化位点预测Fig. 4 Predicted phosphorylation sites on MYB14 protein

2.2.5 龙眼MYB14 蛋白质二级结构与三级结构预测分析 龙眼MYB14 蛋白二级结构主要由无规则卷曲和α-螺旋构成，α-螺旋占39.13%，β-折叠占1.45%，无规则卷曲占59.42%。通过 Phyre 2 在线工具预测龙眼MYB14 蛋白三级结构，发现龙眼MYB14 蛋白主要由α-螺旋和无规则卷曲组成（图5-A）。

同时将龙眼MYB14 的三级结构预测结果和与其基因序列相似度最高的3 个物种柑橘MYB 组蛋白XM_006475428.3、大麻MYB 组蛋白XM 030635592.1、山茶端粒重复结构因子蛋白XM 028218414.1 三级结构的预测结果进行比对，四者基因序列高度相似，龙眼MYB14编码蛋白与大麻和山茶重复端粒结构相似，与柑橘组蛋白结构相似度较低。

2.2.6 龙眼MYB14 蛋白质进化树构建和多重序列比对 将龙眼MYB14 氨基酸序列与NCBI 中相似度较高的12 种植物氨基酸序列进行系统进化树的构建与分析（图6），结果发现龙眼MYB14 与大麻组蛋白XM 030635592.1 的亲缘关系较近。

图 5 不同物种MYB 蛋白三级结构预测Fig. 5 Predicted tertiary structure of MYB proteins from different species

图 6 龙眼MYB14 蛋白与其他物种MYB 蛋白的系统进化树比较Fig. 6 Phylogenetic trees of longan MYB14 and MYB proteins of other species

使用软件DNAMAN V6 对龙眼MYB14和其他物种同源基因进行多重序列比对（图7），发现龙眼MYB14中含有MYB-related 基因家族典型保守序列LKDKWRN，确定该序列为MYB-related 基因家族中的一员。

图 7 不同物种同源基因的氨基酸序列比对结果Fig. 7 Homologous amino acid sequence alignment on genes of different species

2.3 龙眼MYB14基因的表达载体构建结果分析

将目的基因连接连接到具有XbaI 和SmaI 酶切位点的pBI121 载体上，使用Npt II-F 和Npt II-R 以及35S 和CBD MYB14-R 两对引物分别对连接产物进行检测（NptII 为pBI121 质粒抗性基因，35S 为pBI121质粒启动子）。引物35S 和CBD MYB14-R 的菌液PCR 扩增检测结果（图8-a）及引物Npt II-F 和Npt II-R 引物菌液PCR 扩增检测结果（图8-b）均获得900 bp 左右的基因片段，结果说明超表达载体已成功构建[13]，为下一步侵染拟南芥、研究该基因功能奠定了基础。

图 8 载体构建结果检测Fig. 8 Detection of constructed vector

3 讨论与结论

本研究利用得到的龙眼转录组数据库序列信息，筛选并结合克隆技术，成功获得了龙眼MYB14基因，通过生物信息学分析软件发现MYB14属于MYB 基因家族中的Myb-related 亚家族下的亚家族分支TBP-like，全长831 bp，编码276 个氨基酸，含有一个Myb-related 保守结构域LKDKWRN。分析结果表明MYB14基因蛋白属于亲水蛋白，不稳定蛋白。通过在线软件NCBI-CDS 对与龙眼MYB14基因亲缘关系最接近的物种比对发现龙眼MYB14与大麻组蛋白XM 030635592.1 的亲缘关系最接近。

目前已知转录因子MYB14是激活白藜芦醇合成酶的转录因子，是调控芪类化合物生物合成所必需的调控因素之一[15]。过表达vqMYB14可明显提高野生毛葡萄芪类物质的主要含量和芪的生物合成基因的表达[16−17]。肖前林[18]发现ZmMYB14能通过直接与淀粉合成相关酶基因启动子pZmGBSSI、pZmSSI 以及pZmSBE1 相结合，促进启动子的活性；胚乳过表达MYB14可提高玉米淀粉含量[19]，此外，通过在柿果圆片上瞬时超表达DkMYB14，首次发现了DkMYB14是调控中国甜柿自然脱涩的关键基因，该基因的发现对完全甜柿的分子育种和遗传改良具有重要意义[20]。有研究发现在转录因子与结构基因之间，PlMYB10和PlMYB14与四川独蒜兰花青素合成通路上10 个结构基因存在调控关系，通过进一步比较PlMYB14与此10 个结构基因的表达模式后发现PlMYB14很可能调控PlCH3和PlCHS5在白色花中的高水平表达[21]。在龙眼成花研究方面发现在40 个UBC 基因家族中，有11 个DLUBC基因可能对四季蜜龙眼成花诱导具有重要意义[22]。还有研究表明18 个DLWARKY 基因可能参与四季蜜龙眼成花诱导和永久开花性状的遗传控制[23]。而关于MYB 基因家族对龙眼成花诱导方面的研究甚少，未见有MYB14在龙眼中的研究报道。本研究探索MYB14在植物内的功能作用，丰富MYB-related 基因家族成员基因的研究，对龙眼MYB14基因进行克隆及生物信息学分析，并构建了超表达载体，为该基因后续功能的研究提供生物信息学参考。