陈家显，刘先霞，陈跃武，陈磊，张远生

心血管疾病是全球主要的死亡原因，其患病率随着年龄增长而增加[1]。许多心血管疾病，包括冠状动脉疾病和瓣膜性心脏病等，需要外科手术作为治疗的一部分。在心脏手术中，心脏容易受到缺血再灌注损伤（IRI）[2,3]。芪参益气滴丸（Qishen Yiqi dripping pills，QSYQ）是由黄芪、丹参、三七、降香等有效成分组成的中药滴丸，由天士力制药集团股份有限公司生产，2003年国家食品药品监督管理局批准用于治疗缺血性心脏病的中药[4,5]。实验研究提示芪参益气滴丸可通过预防心脏心室重塑、抑制血小板聚集、增强心功能和降低血清脑钠肽等多种机制，对IRI产生作用。研究表明，芪参益气滴丸能改善IRI患者的心功能和显著改善心肌损伤，且无严重副作用[6,7]。本研究通过建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，探讨芪参益气滴丸对假手术组（Sham）和心肌缺血再灌注组（I/R）组大鼠血流动力学的影响，和大鼠血清中炎症相关因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素6（IL-6）的影响和对大鼠心肌组织中MAPK/JNK/ERK1/2信号通路相关蛋白的影响，以此探讨芪参益气滴丸治疗缺血再灌注损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 雄性SD大鼠，体质量为（220±20）g，SPF级，由广西医科大学动物实验中心提供（合格证号 SCXK(桂) 2014-0002）。

1.2 实验药物 芪参益气滴丸由天士力制药集团股份有限公司生产。5%水合氯醛由本医院麻醉科提供。

1.3 试剂与仪器 TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA试剂盒（中国Elascience公司，批号分别为E-E L-H 0 1 4 9 c，E-E L-H 0 1 0 2 c，E-EL-H0109c）。实验所需引物由广州艾基生物技术有限公司合成，p 3 8：上游5'-CCTATCCTGGAAGAGCCATACT -3'，下游5'-ACTTTGTCACGCTGACCAGAT -3'；JNK：上游5'- GTGGGGTATGCCCAAGAGG-3'，下游5'-GCCATAAAGCCCAGATAGAGC-3'；ERK：上游5'- ACTGCTGGGCATAACGCTTTT-3'，下游5'-GAGGAGGATCTTGAGAGCCTT -3'； GAPDH：上游5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游5'-A GGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。GAPDH (CST；Lot No. 4668)，p-JNK (CST；Lot No. 4668)，JNK (CST；Lot No. 9252)，p-p38 (CST；Lot No.9211)。 MB-530 酶标仪（中国BIOBASE公司）；奥林巴斯倒置显微镜（上海普赫光电公司），生理多导记录仪（上海形宙数字技术有限公司），压力-容积测定系统（埃德仪器国际贸易(上海)有限公司），恒温电热毯。

1.4 实验分组与给药 随机将大鼠分为假手术组（Sham）和心肌缺血再灌注组（I/R），后者又分为：模型组（I/R），芪参益气高剂量组（QSYQ-H）和低剂量组（QSYQ-L），每组均为6只。芪参益气滴丸每组的给药浓度，依据成人用量，计算可得QSYQ－H组用0.9%生理盐水配成浓度为600 mg/kg·d，QSYQ-L组300 mg/kg·d。假手术组和模型组大鼠均给予等量生理盐水。每天上午（9:00～12:00）1 次，预给药周期为7 d，在手术前1 h给与最后1次给药。四组大鼠的生长状态好，饮食和进水量情况一致。

1.5 IRI模型建立 四组大鼠禁食12 h于术前，自由饮水，称量大鼠体重，5%水合氯醛腹腔注射麻醉（剂量：6 ml/kg）。建立心肌缺血再灌注损伤模型，严格按照文献[8]进行操作，该模型是缺血30 min后，然后再灌注2 h。

1.6 血流动力学检测 麻醉依据1.5中进行，将大鼠进行固定，进行左室插管，检测血流动力学变化。具体的操作步骤严格按照文献[9]操作，待导管进入左心室后，停止插管。待大鼠平稳后记录大鼠心率（HR）、左心室收缩压峰值（LVSP）及左心室内压最大上升速率（+dp/dtmax）、左心室内压最大下降速率（-dp/dtmax）。

1.7 ELISA法检测血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平 大鼠麻醉后，腹主动脉取血，置于促凝血中，4℃冰箱静置一段时间后，于离心机离心（2000 rpm，6 min）并吸取上清液，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.8 qRT-PCR和蛋白质印迹法检测心肌细胞mRNA和蛋白的水平 取材后置于生理盐水中洗干净，研磨后用Trizol法收集细胞总RNA，并测定其浓度。严格按照TaKaRa试剂盒说明进行逆转录和qRT-PCR。以GAPDH作为内参，用2-△△CT法计算目的基因mRNA的相对表达量。取组织，匀浆后RIPA组织裂解液提取蛋白并进行测量，进行蛋白上样后进行电泳转膜，用封闭液（5%BSA/TBST）封闭1 h，加入抗p38，JNK，ERK和GAPDH（1:1000稀释）一抗，4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入二抗（1:10000稀释）室温下孵育1 h，再TBST洗膜予以ECL系统显影。以GAPDH作为内参，Image J软件采集条带灰度值，取目的条带灰度值与内参条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学处理 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间均数的比较采用t检验及方差分析，所有实验至少重复3次，P＜0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芪参益气滴丸对大鼠血流动力学的影响 与假手术组相比，模型组大鼠反映左室收缩功能的指标LVSP和+dp/dt max 和反映舒张功能的指标-dp/dt max明显较低（P＜0.01）；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01，表1）。

2.2 芪参益气滴丸对大鼠血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响 与假手术组相比，模型组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显升高差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显降低，且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应 ，差异有统计学意义（P＜0.01），表2。

2.3 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞MAPK通路中p38、JNK和ERK mRNA表达水平的影响 与假手术组相比，模型组对大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA含量明显升高，且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应 ，差异有统计学意义（P＜0.01），表3。

2.4 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞MAPK通路中p38、JNK和ERK蛋白表达水平的影响 与假手术组相比，模型组对大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK 蛋白含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK蛋白含量明显升高，且芪参益气滴丸高及低剂量组呈浓度依赖效应，差异有统计学意义（P＜0.01），图1、表4。

表1 芪参益气滴丸对各组大鼠血流动力学的影响

表2 芪参益气滴丸对各组大鼠血浆中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的影响

3 讨论

芪参益气滴丸的滴丸制剂是由黄芪、丹参、三七、降香组成，是现代滴丸制剂技术和中药的完美结合。方中黄芪，取其元气，使气旺行津利尿；丹参及三七活血，通络止痛；降香气香辛散，温通行滞[10]。芪参益气滴丸在作用心血管疾病有良好疗效。研究表明，芪参益气滴丸抑制环磷腺苷的减少，增强心肌收缩力，使患者的心脏的氧血流量增加[10-12]；有明显的减轻心脏的负荷，另具有抗病毒及增强机体免疫力作用；具有抗氧化和稳定心肌能量代谢，抑制血液黏度增加，有效缓解动脉痉挛[13,14]。可关于芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的的作用及对MAPK/p38/JNK/ERK信号通路的具体机制还尚未充分阐明。本文研究发现芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤后，与假手术组相比，模型组大鼠反映左室收缩功能的指标 LVSP和+dp/dt max和反映舒张功能的指标-dp/dt max明显较低；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均显著升高，这一结果能进一步说明芪参益气滴丸能有效改善大鼠的血流动力学，使心肌的收缩力增强。

表3 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞MAPK通路中p38、JNK和ERK mRNA表达水平的影响

图1 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞MAPK通路中p38、JNK和ERK蛋白表达水平的影响

表4 芪参益气滴丸对大鼠心肌细胞MAPK通路中p38、JNK和ERK蛋白表达水平的影响

TNF-α是炎症反应的启动细胞因子，生理状态下有助于增强免疫力，但当超过一定量时可增大和加重炎症反应，引起多种病理性的损伤[15]。IL-1β和IL-6也是具有多种生物学功能的促炎细胞因子，其释放增加可加速血管内皮细胞的损伤，进而进一步导致缺血再灌注损伤[16,17]。IL-1细胞因子包括IL-1β、IL-1α和IL-1Ra等家族，其中因子IL-1β与炎症的发生发展关系最为密切，主要是在炎症或者免疫状态下，由激活的巨噬细胞和单核细胞分泌促炎性细胞因子，是机体调控炎症反应与免疫应答的重要因子[18]。周荣华通过对涞源县医院210例有炎性反应的冠心病患者研究发现，使用芪参益气滴丸可通过降低炎性因子IL-6、血清超敏C反应蛋白（hs-CRP）和TNF-α水平，并且有效改善患者心肌细胞损伤程度，从而减少因炎症反应而引起的一系列心血管事件[19]。周智等[20]研究发现，芪参益气滴丸治疗慢性心力衰竭患者后患者血清炎性因子，比如TGF-β、TNF-α和IL-6均较治疗前降低，能抑制心肌细胞受损伤，增加心肌的收缩力。与此相似的是，本研究结果显示与假手术组相比，模型组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显升高，差异有统计学意义；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠血浆中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量明显降低，呈浓度依赖效应，差异有统计学意义，以上结果表明，芪参益气滴丸可通过调节炎性因子水平改善患者心肌收缩力和心肌能量代谢，对心肌缺血、心肌缺血再灌注损伤有良好的治疗效果[19]。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族主要包括p38，JNK，ERK等亚族，这些亚族是信号通路的枢纽，激活时其蛋白磷酸化水平升高，介导一系列细胞的增殖和炎症反应[21]。研究发现p38主要介导细胞的炎症、凋亡等，因而在临床上可能成为开发抗炎药物的靶位；JNK是各种应激原作用的信号转导过程中的关键分子，参与细胞对炎症、温度和渗透压变化等应激反应；ERK广泛存在于各种组织，参与细胞的炎症反应和增殖分化等过程，多种炎症反应的过程都需要ERK的活化[22]。陈松等通过研究探讨电针"内关"预处理是否通过p38 MAPK信号通路来影响心肌缺血再灌注损伤，发现使用p38 MAPK通路抑制剂（SB230580）可减弱电针"内关"预处理的这种作用，表明"内关"预处理能激活p38 MAPK，显著改善心肌缺血再灌注损伤后心功能及心肌细胞活性，维持心肌能量代谢的正常进行[23]。也有研究证实针刺“内关”穴可以通过p38 MAPK信号通路，抑制炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，可有效改善心肌缺血，启动内环境的自我保护机制，预防随后可能发生的心肌损害[24-26]。本研究结果显示与假手术组相比，模型组对大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA和蛋白含量明显降低；与模型组相比，芪参益气滴丸高低剂量组大鼠心肌细胞p38、JNK和ERK mRNA和蛋白含量明显升高，呈浓度依赖效应。以上结果表明芪参益气滴丸对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护机制有可能是通过p38/JNK/ERK激活，抑制炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，进而减小心肌缺血再灌注损伤程度。

综上所述，芪参益气滴丸能够减小大鼠心肌缺血再灌注的损伤程度，其机制有可能是通过p38/JNK/ERK激活，抑制炎症相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达，进而保护心肌细胞，有效改善心肌缺血，为揭示芪参益气滴丸在治疗心肌缺血再灌注损伤方面提供参考资料。