马少梅

摘要    本文以北海道黄杨茎段为材料，探讨了不同消毒时间、不同激素浓度配比对北海道黄杨再生体系建立的影响。结果表明，北海道黄杨茎段外植体最佳消毒时间为0.1%升汞处理8 min，最佳诱导培养基为MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

关键词    北海道黄杨;外植体;茎段;组织培养

中图分类号    S792.11        文献标识码    A

文章编号   1007-5739（2020）22-0109-02                                                开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    This paper used the stems of Euonymus japonicu as the materials， explored the effects of different disinfection times and hormone concentration on the establishment of regeneration system. The results showed that the best disinfection effect of the explants of Euonymus japonicus was achieved by 0.1% HgCl2 for 8 minutes，and the optimal induction medium was MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L.

Keywords    Euonymus japonica; explant; stem; tissue culture

北海道黄杨（Euonymus japonicus）是卫矛科卫矛属常绿阔叶树种，具有极强的耐寒特性，能耐-23.9 ℃低温，是我国华北地区抗寒性最好的常绿阔叶乔木[1-2]。北海道黄杨组织培养的成功，为短时间内快繁苗木以满足市场需求提供了技术基础，同时也可为今后研究这一树种的植株再生及外源基因导入，培育抗寒、抗旱新品种提供参考。探索北海道黄杨再生体系的建立，以期为今后做好遗传转化工作奠定基础。

1    材料与方法

1.1    外植体选择

将采集的北海道黄杨枝条用自来水和软毛刷洗刷干净，在超净工作台上用75%乙醇浸泡10 s，再用0.1%升汞溶液振荡消毒（设10、8、6 min等3个消毒处理），最后用无菌水沖洗5～6次，保证材料表面消毒液冲洗干净，用消毒滤纸吸干表面水分，在无菌条件下将消毒后的外植体切成0.8～1.0 cm的小块，接种到相应的诱导培养基上进行培养[3-4]。

1.2    培养基及配方

本次试验以MS为基本培养基（琼脂4 g/L、蔗糖25 g/L、pH值5.7），配好的培养基用121 ℃的蒸汽高压灭菌锅灭菌20～25 min，待培养基在室温凝固后即可使用[5]。

1.3    茎段愈伤组织诱导

在基础培养基（MS）中按照不同的配比加入不同浓度的2，4-D（0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）、6-BA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和NAA（0.05、0.10、0.20、0.50 mg/L），比较不同激素浓度对北海道黄杨茎段愈伤组织诱导的情况，从而筛选出最佳诱导培养基。

1.4    培养条件

外植体培养条件为室内温度20～25 ℃，光照时间每天10～12 h，光照强度1 000～1 200 lx。同时，做好培养室的消毒工作，以免因外界环境消毒不彻底，增加外植体污染概率[6-7]。

2    结果与分析

2.1    不同消毒时间对外植体灭菌成活率的影响

北海道黄杨外植体经灭菌后接种在相应的芽诱导培养基上进行诱导培养，培养2周后调查其成活率。结果表明：北海道黄杨外植体用0.1%升汞处理10 min，茎段污染率最低（5%），茎段诱导成活率为40%;外植体用0.1%升汞处理8 min，茎段污染率为10%，成活率最高（70%）;外植体用0.1%升汞处理6 min，茎段污染率为40%，成活率为30%（表1）。通过试验对比，北海道黄杨外植体的最佳消毒时间为8 min，此时外植体污染率较少，植株成活率最高。如果消毒时间过短，植株容易受到污染;消毒时间过长，植株极易被消毒液杀死。

2.2    不同激素浓度对茎段诱导愈伤组织的影响

将经过消毒的北海道黄杨外植体切成0.8～1.0 cm长的切段，接种于茎段愈伤组织诱导培养基上进行培养。结果表明，相同浓度的6-BA和2，4-D对北海道黄杨茎段愈伤组织诱导效果不同。相同浓度6-BA对北海道黄杨外植体诱导效果不如2，4-D，相同浓度的6-BA对愈伤组织的启动时间比2，4-D晚，相同时间诱导率也没有2，4-D高。同时，随着细胞分裂素6-BA和2，4-D浓度的提高，茎段愈伤组织启动时间越早，愈伤组织的形成率也越高，但并不是激素浓度越大越有利于愈伤组织和不定芽的形成。如表2所示，2，4-D浓度越大，其诱导的愈伤组织褐化情况越严重，形成的愈伤组织质量越差，越不利于芽的诱导。在相同的细胞分裂素条件下，添加不同浓度的生长素，北海道黄杨外植体芽诱导情况也不同，生长素浓度越高，不定芽死亡率也越高。由此可知，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是茎段诱导愈伤组织，进而诱导不定芽的最佳培养基。

2.3    北海道黄杨再生植株的分化培养

将已经诱导成功的不定芽接种到相应的分化培养基上进行试管苗的分化培养，相应的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，培养20 d左右，在芽基部逐渐开始出现绿色芽点，30 d左右便有鲜嫩的植株形成，芽的分化系数约为4。

2.4    再生植株的生根及移栽

将经过复壮培养的北海道黄杨试管苗接种到相应的生根培养基进行生根培养，生根培养基为1/2MS+IBA 1.0 mg/L+NAA 0.02 mg/L，约20 d植株基部便有非常茁壮的不定根生成，待生根率达到70%左右、植株具有2条以上根系、根长达1 cm时，即可将组培苗转移到干净、通风良好的温室内进行炼苗培养，1周后用小镊子取出小苗，洗净根上的琼脂，栽植于配比为蛭石∶珍珠岩=3∶1的基质上进行培养。试管苗是否能够移栽成功，除要求试管苗生长健壮、根系发育完整、根的维管束与茎相连之外，移栽后的养护管理也是非常关键的环节。试管苗移栽后的养护管理主要应注意以下几个方面，即保持小苗的水分供需平衡、防止菌类滋生、保持一定的光温条件、保持基质适当的通气性、防止风雨的影响等。总而言之，就是在光、温、水、气、肥各方面对小苗的整体生长环境进行调控[8-9]，以保证其生长健壮。

3    结论与讨论

（1）利用北海道黄杨的茎段作为外植体进行离体培养，既可以进行快速繁殖，又可以保持植株遗传性状的稳定性。

（2）北海道黄杨的外植体在75%乙醇消毒的基础上，再用0.1%升汞进行8 min消毒处理，外植体污染率较低，成活率较高，是最佳的消毒处理时间。

（3）不同的培养基配比及激素浓度，对茎段不定芽的诱导率有很大的影响。激素浓度过高、过低都不利于芽的诱导及成苗，经过不同浓度梯度的自由组合筛选发现，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L是适合北海道黄杨茎段不定芽诱导的最佳培养基，不仅能保证较高的诱导率和成苗率，而且褐化程度不高，苗生长健壮。

（4）建立植物的再生体系主要是利用植物细胞的全能性，除了利用其根、茎、叶外，还可以利用花、果实、种子以及其他组织、细胞和原生质体等作为外植体建立再生体系。

4    参考文献

[1] 陈正华.木本植物组织培养及其应用[M].北京：高等教育出版社，1980：45.

[2] 胡尚连，王丹.植物生物技术[M].成都：西南交通大学出版社，2004：54.

[3] 曹孜义，刘国民.实用组织培养教程[M].兰州：甘肃科学技术出版社，1996：78-80.

[4] 李云，梁庆丰，赵芳，等.北海道黄杨的组织培养[J].植物生理學通讯，2003，39：352.

[5] 李合生.现代植物生理学[M].北京：高等教育出版社，2006：40-45.

[6] 马杰，郭利勇，崔波，等.金边北海道黄杨再生体系的建立及其快繁初探[J].安徽农业科学，2008，36（6）：2245-2246.

[7] 刘晓东，周鑫.北海道黄杨树的组织培养[J].植物生理学通讯，2003，39：236.

[8] BONNEAU L，BERANGER-NOVAT N，MONIN J，et al.Sti-mulation of root and somatic embryo production in Euonymus europaeus L. by an inhibitor of polyamine biosynthesis[J].Plant Growth Regulation，1995，16：5-10.

[9] KIM M K，SOMMER H E，BONGARTEN B C，et al.High-frenquency induction of adventitious shoots from hypocotyls segments of Liquiambar styraciflua L. by thidiazuron[J].Plant Cell Reports，1997，16：536-540.