黄松殿 俞建妹 龙敏 刘芳 沈遐

摘 要：采用5%浓度的洗洁精对异叶南洋杉茎段预处理后污染率为80.00%。选用添加PVP药品0.05g的5%次氯酸钠溶液消毒灭菌时间12min，污染率为53.33%，但对茎段有一定的损伤作用。始芽诱导最佳时间为春末夏初，从母株基部采取健壮芽，保留钻形叶接种后分化不定芽时间为26d，始芽生长健康。

关键词：异叶南洋杉;外植体;预处理;消毒灭菌

中图分类号：S722.3+7

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115025

收稿日期：2020-10-10

基金项目：南宁良凤江国家森林公园“南宁树木园优质用材树种科研项目培育与深化”（项目编号：ky2018001）

作者简介：黄松殿（1966-），男，本科，高级工程师。研究方向：森林培育、植物栽培、植物分类学。

异叶南洋杉（学名：Araucaria heterophylla（Salisb.）Franco）是南洋杉科南洋杉属植物，乔木，在原产地高可达50m以上[1]。异叶南洋杉树干通直，树皮暗灰色，树冠塔形，树姿优美，我国广东、福建、广西等地均有引种栽培，是南方园林绿化的优良树种，也是世界著名的公园绿化树种。其木材纹理美观，是木质家具贴面的优良用材树种。异叶南洋杉种子结实率较低，南宁树木园于20世纪80年代初引种的数十棵异叶南洋杉苗木至今仍未见结实现象。关于异叶南洋杉育苗方面的报道甚少，迄今只查到危孝棋团队于1989—2004年报道关于异叶南洋杉根接、萌条扦插及根插繁殖技术研究的3篇文章[2-4]，及彭东辉等申请的专利“一种异叶南洋杉水培根诱导与培养技术”[5]，并未见组培方面的报道。异叶南洋杉不定芽小枝的叶排列密集，开展，钻形，光绿色，向上弯曲，通常两侧扁，具3～4棱，上面具多数气孔线，易附着微生物，清理难度大，不易获得无菌体。为此，南宁树木园于2018年开始立项进行组织培养研究，力争筛选出异叶南洋杉组织培养适宜的外植体类型，取材时间及其消毒方法，为之后的无性繁殖提供技术支持，为以后规模化培育优质苗木应用于市场打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来源于良凤江国家森林公园（南宁树木园）。以三十二年生，胸径30.0～33.9cm，树高22.6～25.0m，枝下高5.6～8.8m，树干通直、宝塔式树冠的优良单株基部萌芽、树干不定芽为外植体。试验时间为2018年8月—2020年9月。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理对外植体消毒效果的影响

将采回的外植体修剪成4～6cm，在流水中冲洗5～8min后用干净的棉花擦拭茎段及钻形叶除去表皮上的灰尘和杂物等，选用洗洁精、洗衣粉、多菌灵5%浓度的溶剂分别浸泡15min，再用流水冲洗30min，后用蒸馏水冲洗6次，转入超净工作台，备用。消毒剂选用0.1%升汞消毒6min，待消毒处理后的外植体均接到始芽诱导培养基上培养，统计污染率。

1.2.2 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响

将外植体按1.2.1方法预处理后，分别放入不同消毒剂中进行处理，消毒剂组合有：先用75%酒精浸泡20～30s，后将外植体用0.1%升汞消毒（①）;先用75%酒精浸泡20～30s，后将外植体用0.1%升汞消毒，滴入3mL吐温80（②）;先用75%酒精浸泡20～30s，后将外植体用0.1%升汞消毒，添加PVP药品0.05g（③）;5%次氯酸钠溶液，滴入600青霉素（④）;5%次氯酸钠溶液，滴入3mL吐温80（⑤）;5%次氯酸钠溶液，添加PVP药品0.05g（⑥）。

①②③处理的消毒时间分别为3min、6min和9min，④⑤⑥处理的消毒时间分别为8min、10min和12min，不间断搅拌后再用无菌水冲洗4～6次，每个处理接种30个，3次重复。3～60d后统计污染率及枯死率。

1.2.3 不同外植体取材部位消毒效果的影响

依据植物生长特性，供体植株的外植体取材部位的不同可导致外植体生理状态上的差异[6]。有研究表明，同一器官的不同部位取下的相同类型组织，其再生能力也不同[7]。本试验外植体采集分为伐木树桩萌芽、完整木基部促芽萌芽及树干节间处促芽萌芽，茎段在进行预处理及消毒处理后接入始芽诱导培养基中，每个处理接种30个，3次重复。3d后观察，统计污染率与萌芽时间。

1.2.4 不同外植体取材季节对消毒效果的影响

在春季3月、夏季4—6月、秋季7—9月及冬季10—11月连续取材，分别取伐木树桩萌芽、完整木基部促芽萌芽及树干结节处促芽萌芽。进行取材季节对外植体萌芽率的影响的比较。每个处理接种30个外植体，3次重复。3d后观察，统计污染率与萌芽率。

1.2.5 去留外植体钻形叶对消毒效果的影响

茎段在进行預处理及消毒处理后分为保留钻形叶及去除钻形叶2种外植体，分别接入始芽诱导培养基中观察其感菌及褐化情况。每个处理接种30个外植体，3次重复。3d后观察，统计污染率及褐化率。

1.3 培养条件

初代诱导培养基为1/2MS加6-BA2.0～5.0mg·L-1加IAA1.0～3.0mg·L-1加CH250mg·L-1，白糖30g·L-1，琼脂5g·L-1，pH6.0。培养基在1.1MP，121℃高温高压条件下灭菌消毒15min。培养室温度26±2℃，光照时间12～14h·d-1，光照强度800～2000lx。新转接的培养物，在800lx光照条件下培养7～10d。

1.4 数据分析方法

试验数据采用Excel 2017、SPSS22.0进行数据统计及显著性分析，统计污染率、褐化率、萌芽率。

2 结果与分析

2.1 预处理对外植体消毒灭菌效果的影响

从图1可知，采用洗洁精、洗衣粉为预处理剂对异叶南洋杉茎段处理后，茎段在前3d开始出现污染现象，说明其表面菌类未得到较好清理，在30d内污染情况持续上升趋向稳定，在30～60d仍然有部分茎段存在污染现象，主要表现为内源菌污染;采用多菌灵预处理剂处理后的茎段，表面污染开始时间在3d后，且在30d内污染率相对低，可能原因为多菌灵对茎段表面菌类具有相对较好的杀菌效果，但其对茎段内源菌的消毒效果相对较差，在30～60d期间内源菌污染率近40.00%，总污染率达90.00%。综上所述，洗洁精对茎段的预处理效果相对较好，接种后60d污染率控制在80.00%。

2.2 不同消毒剂组合对外植体消毒效果的影响

从表1可知，5%次氯酸钠溶液对异叶南洋杉茎段消毒效果相对较好，污染率低于64.00%，但其对茎段的损伤力较大，茎段枯死率在15.00%以上;为了能较好地降低污染率及枯死率，在消毒剂溶液中添加吐温80或PVP，一定程度能起到助力消毒及抑制污染的效果;PVP的抑制污染效果相对较好，而在5%次氯酸钠溶液中添加600青霉素对消毒作用也起到一定的改善作用。

2.3 不同外植体取材部位对消毒及萌芽的影响

从表2可知，完整木树干节间萌芽污染率相对较低，伐桩萌芽其次，完整木基部萌芽最高，这与植株所处环境相关，取材地位于森林景区，菌类繁多，越接近地面，菌种越繁杂，去除外植体表面菌类难度越大。伐桩萌芽茎段因集聚树兜及根系的营养供应，粗壮，始芽分化时间快，在第26天开始分化成可视芽，芽尖圆润饱满，健康;完整木基部萌芽茎段开始分化成可视芽时间为第45天，芽尖饱满;完整木树干节间萌芽茎段开始分化成可视芽时间为第62天，芽尖纤细，偏淡黄。从茎段的始芽分化情况可知，其分化出的新芽跟其茎段内含养分有关，芽分化时间相对较长，原茎段基部形成愈伤时间长不能从培养基中吸取养分，如其体内的养分含量不足易导致不定芽难以分化，抽长生长，茎段易褐化枯死。因此，从母株基部采取健壮芽为外植体利于不定芽分化及抽长生长。

2.4 不同外植体取材季节对消毒效果的影响

从图2可知，在四季中采集外植体的时间对消毒及不定芽萌芽影响较大，根据自然界的菌类繁衍规律及植株的生物学特性，植株不同时节的抽芽生长结实均需遵循物候期。根据本试验结果可知，异叶南洋杉进行消毒建立无菌体系的最佳时节为春末夏初，外植体生长点集聚的养分多，分化能力强，利于形成健康的不定芽。秋冬季分化的少量不定芽长势弱，难以自养，易褐化，难以形成健壮芽苗。

2.5 去留外植体钻形叶对消毒效果的影响

从试验结果统计可知，保留外植体钻形叶的污染率为70.00%，褐化率为13.33%;去除外植体钻形叶的污染率为46.67%，褐化率为100.00%。异叶南洋杉嫩枝钻形叶排列密集，保留时难以清理叶腋菌类个体，去除后由于茎段伤口过多既不利于消毒剂处理也不利于接种后伤口愈合，易导致褐化枯死。因此，在进行外植体消毒过程中最好是保留钻形叶。

3 结论与讨论

异叶南洋杉钻形叶密集，叶腋处易积菌难以清除，用软毛刷除尘易伤皮，茎段易褐化枯死;用流水冲洗或棉布清洗不易清除边角灰尘，滋生真菌、细菌，不易获得无菌体。在试验中采用5%浓度的洗洁精对异叶南洋杉茎段的预处理效果相对较好，接种后60d污染率控制在80.00%;在消毒过程中选择5%次氯酸钠溶液及添加PVP药品0.05g的消毒剂消毒时间12min，污染率可控制在53.33%内，但对茎段有一定损伤作用。从母株基部采取健壮芽开始分化不定芽时间为第26天，始芽生长健康;始芽诱导时间较长，通常需60d才发生始芽分化，而茎段保鲜时间通常在26～62d逐渐出现褐化现象，难以维持到不定芽分化生长阶段。从目前情况来看，为了能获得较多可应用的外植体，需加大消毒数量，通过增加消毒基数，或在林区时先进行不定芽消毒处理后再进行采集，以获得更多可用芽。

参考文献

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第7卷）[M].北京：科学出版社，1978：28.

[2]危孝棋，陈正福.异叶南洋杉根接初报[J].福建林学院学报，1989，9（04）：427-428.

[3]危孝棋.異叶南洋杉萌条扦插的初步研究[J].林业勘察设计，1998（01）：59-61.

[4]危孝棋，刘芳，林斌.异叶南洋杉根插繁殖技术研究[J].林业实用技术，2004（06）：10-11.

[5]彭东辉，兰思仁，吴沙沙，彭鸿俊，周育真，江鸣涛，陈进燎.一种异叶南洋杉水培根诱导与培养技术[P].福建：CN103125356A，2013-06-05.

[6]许益娟.茶树组织培养再生体系优化与遗传转化的研究[D].南京：南京农业大学，2012.

[7]郭勒滚，肖光玉.茶树组织培养的影响因素及应用展望[J].农业开发与装备，2015（05）：56.

（责任编辑 李媛媛）