李闯 楚海娇 刘磊 谭化 王洋 王凤 张海 王忠伟

摘 要：以苦菜幼嫩叶片和叶柄作为外植体，采用3种诱导培养基、添加不同2，4-D浓度及碳源进行苦菜愈伤组织诱导。结果表明：3种培养基的诱导效果为MS>N6>B5;以幼嫩叶片为外植体、蔗糖作为碳源、2.0mg·L-16-BA加0.2mg·L-12，4-D的激素配比最有利于苦菜愈伤组织的诱導。

关键词：愈伤组织;诱导条件;外植体

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115001

收稿日期：2020-10-15

基金项目：吉林省科学技术厅项目（项目编号：20200702017NC）

作者简介：李闯（1984-），男，助理研究员。研究方向：马铃薯的育种和栽培;通讯作者王忠伟，男，研究员。研究方向：马铃薯的育种和栽培。

苦菜[Ixeris Chinensis（Thunb.） Nakai]又称苦苣菜，是一种药食同源的无毒野生植物[1]。苦菜幼苗富含蛋白质、糖类、维生素、氨基酸等多种营养成分，具有很高的食用价值[2]。同时其药用价值也不容忽视，很多古典文献上都出现了以苦菜为中药成分的记载。研究表明，苦菜不仅具有杀菌消炎、防止贫血、清热解毒等作用[3]，同时对葡萄球菌、大肠杆菌等多种细菌有抑制作用[4]。为了使得苦菜的药用价值不断提升，有关苦菜生物活性物质的研究报道越来越多，而对苦菜的组织培养研究报道较少。组织培养属于无性生殖的范畴，该技术对于培育新品种、快速繁殖、遗传转化、种质资源保护和相关药品开发等方面具有非常重要的意义[5]。愈伤组织的诱导是组织培养的起始阶段，能否得到生长旺盛和易于分化的愈伤组织是试验成功的关键[6]。培养基在细胞生长过程中起决定性作用，其会影响苦菜愈伤组织诱导、分化及生根等一系列过程。本试验分别采用苦菜叶片和叶柄作为外植体，在3种诱导培养基中诱导愈伤组织，同时探讨不同2，4-D浓度和碳源的影响，以期获得苦菜愈伤组织的最佳诱导条件，旨在为苦菜的快速繁殖提供有效途径，同时为苦菜遗传转化和细胞工程研究创造有利条件[7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生苦菜，采于吉林农业科技学院校园。

1.2 诱导培养基

MS培养基、N6培养基、B5培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 材料灭菌

选取叶片和叶柄分别放入500mL烧杯中，用自来水洗涤4次，每次约1min。分别用0.1%的HgCl2和70%的酒精浸泡消毒，无菌水冲洗[8，9]。

1.3.2 愈伤组织诱导条件的筛选

1.3.2.1 培养基的筛选

配制MS、N6和B5 3种诱导培养基进行试验。在此过程中，不定芽较易萌发，影响愈伤组织的生长，用镊子将芽夹去，可以提高愈伤诱导率。

1.3.2.2 外植体的筛选

将消毒后的嫩叶切成1cm2大小的方块，叶柄为1cm左右的小段，接种到诱导培养基上，观察愈伤组织诱导情况。

1.3.2.3 2，4-D浓度的筛选

配制2，4-D浓度分别为0.00mg·L-1、0.05mg·L-1、0.10mg·L-1、0.20mg·L-1、0.50mg·L-1的MS培养基进行试验。

1.3.2.4 碳源的筛选

配制不含碳源和含有相同浓度蔗糖、葡萄糖及麦芽糖的MS诱导培养基进行试验，观察愈伤组织诱导情况。

1.3.3 诱导率的计算

诱导率=愈伤组织数/接种外植体总数×100%

2 结果与讨论

2.1 培养基的筛选

诱导培养基中包含大量元素、微量元素、有机元素、生长激素及碳源等[10]，其植物生长提供所需的各种营养成分。本试验中MS、N6、B5 3种培养基对苦菜愈伤组织的诱导产生了不同效果。接种14d左右时发现，在MS培养基中的叶片卷曲，切口处有突起，开始出现初始愈伤。继续培养28d左右发现，N6和B5培养基中的叶片表面也开始有初始愈伤出现;而此时以叶柄为外植体的3种培养基中也均诱导出初始愈伤。继续培养直至所有愈伤组织状态稳定后，统计结果见表1。

由表1可以看出，在MS培养基中，叶片和叶柄的愈伤组织诱导率均最高，其原因可能为MS培养基中氮、钾等无机盐浓度较高，能促进愈伤组织的快速形成[11];叶片在N6培养基中的诱导率也较高，但形成愈伤组织所需的时间较长;而在B5培养基中的出愈率仅为12%，且长时间诱导叶片绝大部分褐化。以叶柄为外植体，在N6和B5培养基中的出愈率均较低。因此认为，3种培养基的诱导效果为MS>N6>B5。在进行植物组织培养时，经常出现褐化现象，有试验表明酚类物质的含量增加时，褐化率也随之增大，成活率随之减小[12]。本试验中由于外植体切块太小、所用培养基不适宜而造成了部分褐化现象。

2.2 外植体的筛选

试验分别选取苦菜叶片和叶柄作为外植体。接种14d左右时发现，在MS培养基中的叶片卷曲，切口处有突起，开始出现初始愈伤。继续培养28d左右发现，以叶柄为外植体的3种培养基中也均诱导出初始愈伤。继续培养直至所有愈伤组织状态稳定后，此时可进行结果统计（见表2）。

由表2可以看出，MS培养基中的叶片诱导率高于叶柄，但二者相比较，叶柄生长速度较慢，往往需要较长时间才能形成可见的初始愈伤，同时褐化现象也较严重;在N6培养基中，叶片的诱导率也较高，因此认为叶片更适合作为苦菜愈伤组织诱导的外植体。进行植物愈伤组织诱导时，应尽量选择易于增殖和再生，具有良好遗传稳定性的外植体。

2.3 2，4-D浓度的筛选

2，4-D浓度是影响植物愈伤组织诱导率的一个重要激素[13]。6-BA和2，4-D在愈伤组织形成的不同时期具有明显促进作用，6-BA与植株再生有关，2，4-D与愈伤组织的生长状态有关，是愈伤组织生长的关键[14]。本试验在愈伤组织诱导阶段采用6-BA和2，4-D 2种激素，固定6-BA的浓度为2.0mg·L-1，选取5种浓度的2，4-D进行愈伤组织诱导，统计结果见表3。

由表3可以看出，2，4-D浓度为0.2mg·L-1时，苦菜愈伤组织的诱导率最高，且愈伤组织状态良好，大部分呈黄绿色，结构松软;当2，4-D浓度>0.2mg·L-1时，诱导率随2，4-D浓度的增大而减小，诱导形成的愈伤组织大部分为浅绿色，结构较为致密，生长速度较慢，并且出现严重褐化，表明高浓度的2，4-D不利于愈伤组织的诱导和生长，同时加快外植体的褐化;当2，4-D浓度<0.2mg·L-1时，诱导率随2，4-D浓度的减小而减小;当2，4-D浓度=0时，愈伤组织全部死亡。

2.4 碳源的筛选

细胞的生长不仅需要能量，还需要调节生长环境中的渗透压，糖作为碳源能够满足这些需求，因此培养基中的碳源是培养过程中的关键因素[15]。本试验分别在培养基中加入浓度为30g·L-1 3种碳源进行苦菜愈伤诱导研究，结果表明，培养14d后，含有蔗糖的培养基中的苦菜叶片表面形成初始愈伤，其它培养基中的叶片无明显变化;培养21d左右，添加葡萄糖的培养基中的叶片表面也开始形成愈伤，统计结果见表4。

结果显示，不加碳源的培养基中无愈伤组织形成，说明碳源是苦菜叶片愈伤组织形成的必要元素。分别添加不同碳源的3种培养基中均有愈伤组织形成，但诱导率和诱导效果存在很大差别。添加蔗糖的培养基中的出愈率高达到96%，且愈伤组织呈黄绿色，结构松软，生长状态良好;添加葡萄糖的培养基中的出愈率不足50%，且呈现浅绿色，结构较为致密，生长情况较差;麦芽糖的诱导效果最差，几乎没有完整的愈伤组织形成，只有少量叶片的切口处出现点状突起。由此可见，蔗糖为苦菜愈伤组织诱导的最适碳源。

2.5 愈伤组织的继代培养

固定2，4-D浓度为0.1mg·L-1，分别配制MS、N6和B53种培养基进行继代试验。结果发现，在N6和B5培养基上，随着培养时间的增加苦菜叶片愈伤组织的存活数减少，直到最后全部褐化死亡，其中B5褐化的速度最快，因此这2种培养基不适合继代培养;而接种到MS培养基上的大部分生长良好，能保持良好的生长状态，并成功分化出苗。

3 结论

本试验采用不同培养基、外植体、2，4-D浓度和碳源种类对苦菜愈伤组织进行初步诱导研究。得出以下结论：以苦菜叶片和叶柄做外植体，3种诱导培养基的诱导效果均为MS>N6>B5;同时苦菜的2种外植体均能诱导形成愈伤组织，但叶片的诱導率要高于叶柄，且愈伤组织生长状态较好，诱导时间较短，所以苦菜叶片较适合作为苦菜愈伤诱导的外植体。试验表明，2，4-D浓度为0.2mg·L-1时适合苦菜叶片愈伤组织的诱导;3种碳源的诱导效果比较发现，蔗糖>葡萄糖>麦芽糖，因此蔗糖可作为理想碳源;继代培养时，愈伤组织在MS培养基中的生长状况良好且培养后愈伤组织活性很高，能够继续进行分化培养，同时在继代培养时应适当降低2，4-D浓度。

本试验仅对影响苦菜愈伤组织诱导的条件进行优化，为建立完善的苦菜组织培养体系，其继代、分化及生根培养的影响因素，还有待于进一步研究。

参考文献

[1] 王储炎，代君君，吴伟.苦菜的药理作用及产品开发[J].农业工程技术（农产品加工业），2008（02）：36-38.

[2]田芳.苦菜的功能成分及产品开发[J].中国食物与营养，2009（03）：30-31.

[3]刘畅，严铭铭，邵帅，等.山苦菜化学成分及药理作用的研究进展[J].中国试验方剂学杂志，2015（20）：231-234.

[4]傅聿成，王妮娅.苦菜的开发与利用[J].食品研究与开发，2003（06）：90-92.

[5]张淑红.植物组织培养及其发展方向[J].垦殖与稻作，2003（06）：43-45.

[6]张红艳，李冠，李仁敬.彩色棉再生体系影响因子及抗病基因NP-1转化的研究[J].新疆大学学报，2004（02）：94-98.

[7]刘勇，王良群.组织培养在高粱中的应用研究进展[J].安徽农业科学，2015（10）：31-33.

[8]张卓.山苦菜无性系建立的研究[J].河南大学学报（自然科学版），2012（02）：187-191.

[9]于颖，何漫，吴冰冰.苦苣菜再生体系建立研究[J].中国园艺文摘，2009（11）：20-22.

[10]陈静.酚酸类物质与牡丹试管苗生根关系的研究[D].郑州：河南农业大学，2012.

[11]黄晖.细叶野牡丹再生与快繁体系建立研究[D].福州：福建农林大学，2012.

[12]张朝军，李付广，王玉芬.降低棉花胚性愈伤褐化研究[J].棉花学报，2005（05）：285-288.

[13]安惠惠，马晖玲，白生军，等.2，4-D对匍匐翦股颖不同品种愈伤组织诱导和分化的影响[J].草原与草坪，2012（02）：15-19.

[14]关淑艳，赵丽娜，王丕武，等.玉米自交系GS01愈伤组织的诱导及植株再生[J].玉米科学，2011（02）：29-33.

[15]丁世萍，严菊强.糖类在植物组织培养中的效应[J].植物学通报，1998（06）：43-47.

（责任编辑 李媛媛）